劍麻EST-SSR在絲蘭麻和中美麻中的通用性分析

張燕梅 李俊峰 鹿志偉 楊子平 周文釗

摘? 要：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對劍麻‘H.11648中的100對SSR引物在絲蘭麻和萬年蘭中的通用性進(jìn)行分析，同時構(gòu)建DNA指紋圖譜。結(jié)果表明100對SSR引物，在龍舌蘭屬、絲蘭麻屬、中美麻屬中分別有68對、52對和52對SSR引物擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物所占比例分別為68%、52%和52%，多態(tài)性引物分別為18對、12對和9對，多態(tài)性引物所占比例分別為29.51%、23.08%和17.31%。檢測位點數(shù)分別為76、44和40個，平均每對引物多態(tài)位點數(shù)分別為2.67、2.42和2.22個。引物C67656和C61418可將龍舌蘭屬的6份種質(zhì)區(qū)分開來，引物C65059可將絲蘭麻屬的5份種質(zhì)區(qū)分開，引物C24110可將中美麻屬的4份種質(zhì)區(qū)分開。以上研究結(jié)果表明，從‘H.11648開發(fā)的SSR引物在龍舌蘭及其近緣屬中是可以通用的，篩選出的SSR引物可用于龍舌蘭及其近緣屬種質(zhì)資源的鑒定和遺傳多樣性分析等研究。

關(guān)鍵詞：劍麻;EST-SSR;絲蘭麻;中美麻;通用性

中圖分類號：S563.8????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Transferability Analysis of Sisal EST-SSR Markers in Yucca and Furcraea vent

ZHANG Yanmei， LI Junfeng， LU Zhiwei， YANG Ziping， ZHOU Wenzhao*

South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Zhanjiang City Key Laboratory for Tropical Crops Genetic Improvement， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： In this study， polyacrylamide gel electrophoresis was used to analyze the generality of 100 pairs of SSR primers from ‘H.11648 in Agave and its related genus， and DNA fingerprinting was constructed. The results showed that 68， 52 and 52 pairs of SSR primers could amplify the expected products in Agave， Yucca and Furcraea vent， respectively. The proportion of amplified products was 68%， 52% and 52%. 18， 12 and 9 pairs of SSR primers showed polymorphic and the polymorphic percentage was 29.51%， 23.08% and 17.31%. The total number of polymorphic loci was 76， 44 and 40 with average number of polymorphic loci amplified by each primer was 2.67， 2.42 and 2.22， respectively. Primers C67656 and C61418 could discriminate six germplasms in Agave， Primer C65059 could discriminate five germplasms in Yucca， Primer C24110 could discriminate four germplasms in Furcraea vent. The above results indicated that the SSR primer in ‘H.11648 was transferable in Agave and its related genera， which laid a foundation for germplasm identification and genetic diversity analysis of Agave and its related genera.

Keywords： sisal; EST-SSR; Yucca; Furcraea vent; transferability

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.003

劍麻屬龍舌蘭科（Agavaceae）多年生單子葉植物，全世界有20個屬約670種，主要分布在墨西哥等熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]，我國現(xiàn)保存有7個屬約100余份種質(zhì)資源，其中龍舌蘭屬植物較多，作為一種重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，除生產(chǎn)纖維外，劍麻莖心可用來釀酒[2]，麻渣可做飼料、制藥以及肥料等[3]，劍麻亦可作為園林植物，有重要的觀賞價值。

微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），又稱簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat， SSR），是由1～6個核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)而成的長達(dá)幾十個核苷酸的重復(fù)序列，廣泛分布于整個基因組中，按其來源可分為基因組SSR（gSSR）和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）。與其他分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性遺傳等優(yōu)點[4]，可以區(qū)分純合子和雜合子，廣泛應(yīng)用于遺傳分析[5]、種質(zhì)資源鑒定[6]以及遺傳作圖[7]和QTL分析[8]等領(lǐng)域。關(guān)于SSR引物在不同植物中的通用性研究報道較多，王瑞晶等[9]利用小麥EST- SSR對47份偃麥草進(jìn)行遺傳多樣性分析，通用性達(dá)到87.91%。文明富等[10]研究表明，木薯EST- SSR在麻風(fēng)樹和橡膠樹中的通用性分別為37.36%和26.37%。隨著測序技術(shù)和生物信息技術(shù)的迅猛發(fā)展，全球公共數(shù)據(jù)平臺進(jìn)一步開放共享，尤其是對于非模式植物和基因組信息未知的物種提供了良好的機(jī)遇，既可以縮短研發(fā)時間，又能節(jié)約大量的人力和財力。目前有關(guān)龍舌蘭科中報道的SSR引物僅有7對，來自于Agave parryi[11]，主要用于龍舌蘭屬植物遺傳多樣性研究[11-13]，SSR引物偏少，獲得的信息量有限，而且也沒有關(guān)于劍麻SSR通用性研究的報道，張燕梅等[14]利用

‘H.11648轉(zhuǎn)錄組EST序列，開發(fā)100對SSR引物，其中有18對引物在龍舌蘭屬中表現(xiàn)較好的多態(tài)性。鑒于此，本研究擬利用從劍麻中開發(fā)的100對SSR引物，在絲蘭麻和中美麻中進(jìn)行通用性研究，既可以節(jié)約開發(fā)成本，同時為龍舌蘭及其近緣屬的資源鑒定、遺傳多樣性分析以及比較作圖奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗材料? 選用絲蘭麻屬的5份種質(zhì)，中美麻屬的4份種質(zhì)，龍舌蘭屬的6份種質(zhì)，共15份材料，每份材料取2年生吸芽3～5株，每株取1 g葉片等量混合后用于提取基因組DNA。所有材料均保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所劍麻種質(zhì)資源圃（表1）。

1.1.2? SSR引物? 本研究所用100對EST-SSR引物為本團(tuán)隊從‘H.11648轉(zhuǎn)錄組EST序列中開發(fā)的SSR引物，具體見張燕梅等[14]報道的文獻(xiàn)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2? 方法

1.2.1? DNA提取? DNA提取采用天澤公司的柱式植物DNAout試劑盒提取，試驗材料用液氮快速研磨后取少量粉末，加入裂解液、離心后取上清，上清液經(jīng)抽提、漂洗最后過柱，加入100 μL洗脫液將DNA從吸附柱上洗脫下來，4 ℃保存?zhèn)溆?，具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.2? SSR引物通用性分析? 先將每個屬的所有DNA樣本等量混合后構(gòu)建DNA池，以每個屬的DNA池為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步篩選有擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR引物。然后分別以單個樣本的DNA為模板，對有擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選。

PCR反應(yīng)體系。20 ?L PCR反應(yīng)體系中各組份的濃度及使用量：10×Buffer（全式金）：2 ?L;dNTP：1.6 ?L;Easy-Taq（5 U/?L）：0.2 ?L;引物（10 μmol/L）F：0.5 ?L，R：0.5 ?L;DNA：50 ng（1 ?L）;滅菌ddH2O：14.2 ?L。所有試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司的Easy Taq DNA polymerase for PAGE kit。

擴(kuò)增程序。采用Touch-down PCR程序，具體為95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s（=-0.7，即每增加一個循環(huán)，退火溫度降低0.7 ℃），72 ℃ 30s，16個循環(huán);然后進(jìn)入下一個擴(kuò)增階段，95 ℃ 15 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，15個循環(huán);最后72 ℃ 60 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物檢測。PCR產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺=29∶1）電泳進(jìn)行分離，具體參考史衛(wèi)東等[15]的方法并略有調(diào)整。20 ?L PCR反應(yīng)體系加入8 ?L 6loading buffer，混勻后2.5 ?L上樣，250 V，電泳3 h后取下膠板，用雙蒸水沖洗后，加入固定液（10 mL無水乙醇+5 mL冰乙酸，然后用水補(bǔ)足至100 mL）固定7 min，然后加入AgNO3染色液（0.15% AgNO3）銀染10 min，最后加入四硼酸鈉顯影液（100 mL H2O+1.5 g NaOH+0.756 g四硼酸鈉+ 0.75 mL甲醛）顯色，直到顯出清晰的條帶，自來水沖洗后即可拍照。以上操作均在搖床上進(jìn)行。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用人工判讀數(shù)據(jù)，某一位點有產(chǎn)物記為“1”，沒有產(chǎn)物記為“0”，缺失記為“.”，所得數(shù)據(jù)輸入Excel表格后，繪制每個樣本的DNA指紋。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 劍麻SSR標(biāo)記的通用性分析

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對100對劍麻SSR引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，有45對SSR引物在3個屬中均可擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物條帶，有68對SSR引物在龍舌蘭屬中可擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物所占比例為68%。有52對SSR引物在絲蘭麻屬中可擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物所占比例為52%。有52對SSR引物在中美麻屬中擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物所占比例為52%。從而表明從‘H.11648中開發(fā)的SSR引物在龍舌蘭、絲蘭麻以及中美麻等近緣屬中是可以通用的，且引物通用性在52%～68%之間（表2）。

2.2? SSR引物多態(tài)性分析

對擴(kuò)增有目標(biāo)產(chǎn)物條帶的SSR引物進(jìn)行多態(tài)性分析，龍舌蘭屬68對SSR引物中，有18對引物在龍舌蘭屬6個個體中表現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性引物所占比例為29.51%，18對SSR引物可檢測到76個SSR位點，其中每對引物平均檢測到4.22個位點，平均多態(tài)性位點數(shù)為2.67，多態(tài)百分比為63.16%（表3）。絲蘭麻屬52對SSR引物中，有12對引物在絲蘭麻屬5個個體中表現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性引物所占比例為23.08%，12對SSR引物可檢測到44個SSR位點，其中每對引物平均檢測到3.67個位點，多態(tài)百分比為65.91%（表4）。中美麻屬52對SSR引物中，有9對引物在中美麻屬4個個體中表現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性引物所占比例為17.31%，9對SSR引物可檢測到40個SSR位點，其中每對引物平均檢測到4.44個位點，平均多態(tài)性位點數(shù)為2.22，多態(tài)百分比為50%（表5）。只有引物C78304在龍舌蘭、絲蘭麻和中美麻中同時表現(xiàn)出多態(tài)性（圖1）。

2.3? DNA指紋圖譜構(gòu)建

SSR標(biāo)記在指紋圖譜構(gòu)建中的效率與其在研究對象中的多態(tài)性密切相關(guān)，一般多態(tài)性高的標(biāo)記效率高。龍舌蘭屬18對多態(tài)性引物分別可檢測2～6個位點，83.33%的引物檢出位點在4個以上，引物C67656和C61418可將龍舌蘭屬的6份種質(zhì)區(qū)分開。絲蘭麻屬12對多態(tài)性引物分別可檢測2～5個位點，33.33%的引物檢測位點數(shù)在4個以上，其中引物C51788、C75462和C75462可同時

將4份種質(zhì)區(qū)分開，引物C65059可將5份種質(zhì)區(qū)分開。中美麻屬有8對多態(tài)性引物可檢出4個以上位點，多態(tài)性位點數(shù)在1～5個之間，引物C24110可將4份種質(zhì)區(qū)分開。同時根據(jù)分析結(jié)果繪制15份種質(zhì)的SSR-DNA指紋圖譜（圖2）。

3? 討論

近年來，利用植物EST序列開發(fā)EST-SSR引物，并在近緣或遠(yuǎn)緣物種中進(jìn)行通用性分析已成為一種較為常見的引物開發(fā)手段，無論在單子葉植物還是雙子葉植物中均有許多成功的報道。本研究對來自于‘H.11648的100對EST-SSR引物分別在龍舌蘭屬、絲蘭麻屬和中美麻屬中的通用性進(jìn)行分析顯示‘H.11648EST-SSR引物通用性在52%～68%之間，多態(tài)性引物比例在17.31%～29.15%之間，表明劍麻‘H.11648EST-SSR引物在龍舌蘭及其近緣屬中的通用性較高。這與Holton等[16]報道大麥EST-SSR在小麥中的通用性為55%，Malay等[17]研究顯示高羊茅EST-SSR對其他草類通用性為57%，徐磊等[18]報道高粱SSR在割手密中的通用性為70%基本一致。此外，研究也發(fā)現(xiàn)利用‘H.11648EST-SSR開發(fā)的SSR引物，在龍舌蘭及其近緣屬的通用性和多態(tài)性引物比例明顯比Lindsay等[11]報道的基因組SSR通用性高。引物通用性高低既與SSR側(cè)翼序列的保守程度和SSR基序本身在進(jìn)化過程中的穩(wěn)定性有關(guān)[19]，同時也與SSR標(biāo)記來源有關(guān)。

如Xu等[20]發(fā)現(xiàn)北美鵝掌楸SSR標(biāo)記在中國鵝掌楸中的通用性達(dá)到85%。此外，鄭麗珊等[21]研究發(fā)現(xiàn)，雙子葉植物棉花的SSR可在單子葉植物香蕉中通用，且EST-SSR的通用性比基因組SSR高。同樣地，楊彥伶等[22]研究也表明楊樹的EST-SSR在柳樹中的通用性比基因組SSR高，與本研究結(jié)果一致。

SSR標(biāo)記具有豐富的多態(tài)性，利用該標(biāo)記，可較好地區(qū)分不同品種資源[23]。如引物C65059可較好地將絲蘭麻的5份種質(zhì)區(qū)分開。但研究發(fā)現(xiàn)，‘肯1和‘肯2幾乎有相同的指紋，‘肯1和‘肯2均來自肯尼亞，根據(jù)表型很難將二者分開，說明這2份種質(zhì)親緣關(guān)系較近，存在幾乎相同的指紋，一方面可能存在重復(fù)引種，另一方面，可適當(dāng)增加標(biāo)記數(shù)量來進(jìn)一步檢測。此外，盡管100對引物中有43對在龍舌蘭屬、絲蘭麻屬和中美麻屬中都有擴(kuò)增，但最后只檢測到1對引物在這3個屬中同時具有多態(tài)性，究其原因，一方面由于每個屬的個體數(shù)較少，SSR數(shù)量不多，若個體間親緣關(guān)系近則會使多態(tài)性引物減少，另一方面在數(shù)據(jù)分析時，龍舌蘭屬、絲蘭麻屬和中美麻屬是分開分析的，從而導(dǎo)致在某一個或兩個屬中有多態(tài)性的引物未被列入其中，因此可以適當(dāng)增加引物數(shù)量，優(yōu)化反應(yīng)體系，從而達(dá)到更好的檢測效果。

此外，龍舌蘭、絲蘭麻和中美麻同屬龍舌蘭科植物，近緣關(guān)系較近，通過本研究開發(fā)出一套通用的EST-SSR標(biāo)記，不僅可以有效彌補(bǔ)絲蘭麻和中美麻中分子標(biāo)記不足的現(xiàn)狀，豐富標(biāo)記數(shù)量，減少標(biāo)記開發(fā)成本和時間，同時通過不同物種間的比較作圖，揭示其進(jìn)化關(guān)系，為遺傳育種研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]? 莊雪影. 園林樹木學(xué)（華南本）[M]. 廣州： 華南理工大學(xué)出版社， 2014： 289.

[2]? Escalante A， López Soto D R， Velázquez Gutiérrez J E， et al. Pulque， a traditional Mexican alcoholic fermented beverage： historical， microbiological， and technical aspects[J]. Frontiers in Microbiology， 2016， 7： 1026.

[3]? Pereira G M， Ribeiro M G， da Silva B P， et al. Structural characterization of a new steroidal saponin from Agave angustifolia var. Marginata and a preliminary investigation of its in vivo antiulcerogenic activity and in vitro membrane permeability property[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters， 2017， 27（18）： 4345-4349.

[4]? Mason A S. SSR Genotyping[M]// Batley J. Plant Geno-typing. Springer， New York， NY， 2015： 77-89.

[5]? Bibi A C， Gonias E D， Doulis A G. Genetic diversity and structure analysis assessed by SSR markers in a large collection of vitis cultivars from the island of Crete， Greece[J]. Biochemical Genetics， 2020， 58（2）： 294-321.

[6]? Zhao Y， Wang Y， Wang L， et al. Molecular identification of mung bean accessions （Vigna radiate L.） from Northeast China using capillary electrophoresis with fluorescence- labeled SSR markers[J/OL]. Food and Energy Security， 2019， 9（20）， DOI：10.1002/fes3.182.

[7]? Wang Y， Jia H M， Shen Y T， et al. Construction of an anchoring SSR marker genetic linkage map and detection of a sex-linked region in two dioecious populations of red bayberry[J]. Horticulture Research， 2020， 7（1）： 53.

[8]? Daware A， Das S， Srivastava R， et al. An efficient strategy combining SSR markers- and advanced QTL-seq-driven QTL mapping unravels candidate genes regulating grain weight in rice[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 1535.

[9]? 王瑞晶， 李培英. 小麥EST-SSR標(biāo)記在偃麥草中的通用性分析[J]. 分子植物育種， 2016，14（6）： 1516-1523.

[10]???? 文明富， 陳? 新， 王海燕， 等. 木薯基因組SSR和EST-SSR在麻瘋樹和橡膠樹中的通用性分析[J]. 作物學(xué)報， 2011， 37（1）： 74-78.

[11]????? Lindsay D L， Edwards C E， Jung M G， et al. Novel microsatellite loci for Agave parryi and cross-amplification in Agave palmeri （Agavaceae）[J]. American Journal of Botany， 2012， 99（7）： e295-e297.

[12]????? Cabrera-Toledo D， Vargas-Ponce O， Ascenclo-Ramírez S， et al. Morphological and genetic variation in monocultures， forestry systems and wild populations of Agave maximiliana of western Mexico： Implications for its conservation[J]. Frontiers in Plant Science， 2020， 11： 817.

[13]????? Trejo L， Limones V， Pe?a G， et al. Genetic variation and relationships among agaves related to the production of Tequila and Mezcal in Jalisco[J]. Industrial Crop & Products， 2018， 125： 140-149.

[14]????? 張燕梅， 李俊峰， 楊子平， 等. 基于轉(zhuǎn)錄組的劍麻SSR標(biāo)記開發(fā)與鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2021， 42（5）： 1261-1266.

[15]????? 史衛(wèi)東， 羅海玲， 康紅衛(wèi)， 等. 基于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的菜心SCoT分析[J]. 亞熱帶植物科學(xué)， 2020， 49（1）： 1-8.

[16]????? Holton T A， Christopher J T， McClure L， et al. Identifi-cation and mapping of polymorphic SSR markers from ex-pressed? gene sequences of barley and wheat[J]. Mo-lecular Breeding， 2002， 9（2）： 63-71.

[17]????? Saha M C， Mian R， Zwonitzer J C， et al. An SSR- and AFLP- based genetic linkage map of tall fescue （Festuca arundinacea Schreb.）[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2005， 110（2）： 323-336.

[18]????? 徐? 磊， 邢淑蓮， 姚艷麗， 等. 高粱SSR和EST-SSR標(biāo)記在割手密中的通用性分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2015， 31（27）： 164-171.

[19]????? 程小毛， 黃曉霞. SSR標(biāo)記開發(fā)及其在植物中的應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2011， 27（5）： 304-307.

[20]????? 胥? 猛， 李火根. 鵝掌楸EST-SSR引物開發(fā)及通用性分析[J]. 分子植物育種， 2008（3）： 615-618.

[21]????? 鄭麗珊， 石玉真， 王靜毅， 等. 棉花EST-SSRs在香蕉中的通用性[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2008， 24（1）： 33-37.

[22]????? 楊彥伶， 張亞東， 張新葉. 楊樹SSR標(biāo)記在柳樹中的通用性分析[J]. 分子植物育種， 2008， 6（6）： 1134-1138.

[23]????? 王源秀， 徐立安， 黃敏仁. 杞柳和簸箕柳候選雜交親本SSR指紋圖譜分析[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2008， 32（2）： 1-5.

責(zé)任編輯：謝龍蓮