春季和秋季莓葉委陵菜葉片和地下部分蘆丁及兒茶素含量的HPLC分析

周 棟，馬蓓蓓，劉漢柱，辛 華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109)

莓葉委陵菜(Potentilla fragarioides L.)又名雉子筵，為薔薇科(Rosaceae)委陵菜屬(Potentilla L.)多年生草本植物，具有補(bǔ)陰虛、止血、抗病毒等作用，由其制成的莓葉委陵菜膠囊在臨床上用于治療月經(jīng)過(guò)多、功能性子宮出血及子宮肌瘤出血等癥［1－2］。迄今為止，對(duì)莓葉委陵菜其他方面的研究鮮有報(bào)道，僅對(duì)其染色體數(shù)進(jìn)行了研究［3］。委陵菜屬植物普遍含有多種活性成分［4－5］，如黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、萜類(lèi)等；該屬植物委陵菜(P.chinensis Ser.)可用于治療赤痢腹痛、久痢不止、痔瘡出血、臃腫瘡毒等癥［6］。

植物所含的黃酮類(lèi)成分能有效保護(hù)植物抵抗紫外線(xiàn)照射和病菌侵染［7］，已作為主要藥用成分廣泛用于臨床醫(yī)療。蘆丁和兒茶素均屬于黃酮類(lèi)成分，其中，蘆丁具有抗癌、消炎、抗氧化等多種生物活性，已廣泛應(yīng)用于臨床，近年來(lái)還用于治療老年性腦部疾病、抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤增生等［8－9］；兒茶素則具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、抗毒素等作用［10］，還具有抑制血壓及血糖、降低血液中的膽固醇含量、預(yù)防癌癥和心血管疾病等作用［11］。

作者分別對(duì)采自春季和秋季的莓葉委陵菜葉片和地下部分的蘆丁和兒茶素含量進(jìn)行測(cè)定和比較，以期為莓葉委陵菜的合理開(kāi)發(fā)和藥用資源的有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試莓葉委陵菜分別于2009年11月5日和2010年5月7日采自山東省煙臺(tái)市昆崳山。將葉片與地下部分分開(kāi)，洗凈陰干后粉碎并過(guò)60目篩，備用。

所用儀器有Agilent1100型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent科技有限公司生產(chǎn))、FZ 102型微型植物粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn))和KQ 3200 DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn))。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：100080－200707)和兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：877－200001)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純，乙酸為分析純，水為超純水(電阻率為18 MΩ·cm)。

1.2 方法

1.2.1 HPLC色譜條件 Eclipse XDB C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)1％乙酸和甲醇。蘆丁采用梯度洗脫法，洗脫程序：0～40min，V(1％乙酸)∶V(甲醇)=95∶5；40～50 min，V(1％乙酸)∶V(甲醇)=70∶30；50～52 min，V(1％乙酸)∶V(甲醇)=55∶45；52～57 min，V(1％乙酸)∶V(甲醇)= 0∶100；57～62 min，V(1％乙酸)∶V(甲醇)=95∶5。兒茶素采用非梯度洗脫法，流動(dòng)相為V(1％乙酸)∶V(甲醇)=55∶45。柱溫30℃，流速1.0 mL·min－1，進(jìn)樣量20μL。光電二極管陣列檢測(cè)器，蘆丁和兒茶素的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為254和280 nm，出峰時(shí)間分別為43.767和12.557 min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 精確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品4.10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL(質(zhì)量濃度為0.41 mg·mL－1)，搖勻后吸取1 m L并用甲醇定容至50 m L，得到質(zhì)量濃度8.20μg·mL－1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確稱(chēng)取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品3.30 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度0.33 mg·mL－1的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，莓葉委陵菜葉片中的蘆丁含量分別比地下部分高30和50倍，為降低誤差，繪制2條蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(方程1和方程2)，分別用于葉片和地下部分蘆丁含量的測(cè)定。將0.41 mg·mL－1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別稀釋15、12、8、4和2倍，將8.20μg·mL－1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別稀釋25、16、8、4和2倍，按上述HPLC色譜條件分別依次進(jìn)樣測(cè)定，并以蘆丁質(zhì)量濃度為自變量x、峰面積為因變量y分別對(duì)方程1和方程2進(jìn)行擬合。線(xiàn)性回歸方程1為：y=16.383 0x+66.258 0，R2=0.997 1，線(xiàn)性范圍27.33～210.00μg·mL－1；線(xiàn)性回歸方程2為：y=14.142 0x－0.894 5，R2=0.995 7，線(xiàn)性范圍0.34～4.10μg·mL－1。

將0.33 mg·mL－1兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別稀釋25、20、15、10和4倍，按上述HPLC色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，并以?xún)翰杷刭|(zhì)量濃度為自變量x、峰面積為因變量y對(duì)兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程進(jìn)行擬合，線(xiàn)性回歸方程為：y=4.624 4x+10.902 0，R2=0.996 7，線(xiàn)性范圍13.20～82.50μg·mL－1。

1.2.3 樣品溶液制備和HPLC分析 分別稱(chēng)取各樣品粉末1.50 g，加入25 mL甲醇和水的等體積混合溶液，稱(chēng)取質(zhì)量后浸泡1 h，然后超聲處理(30℃，40 kHz)1 h，冷卻至室溫后用甲醇和水的等體積混合溶液補(bǔ)足至浸泡前質(zhì)量，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液即為樣品溶液，按上述HPLC色譜條件進(jìn)樣分析，并根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品曲線(xiàn)計(jì)算樣品中蘆丁和兒茶素含量。

1.2.4 方法學(xué)考察 取8.20μg·mL－1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液按上述HPLC色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，檢測(cè)儀器的精密度。蘆丁峰面積的RSD為0.81％，表明儀器精密度良好。

取莓葉委陵菜春季葉片和秋季地下部分樣品溶液，按照上述HPLC色譜條件分別于0、2、4、6和8 h進(jìn)樣分析，檢測(cè)樣品溶液的穩(wěn)定性。樣品溶液中蘆丁與兒茶素峰面積的RSD分別為1.30％和1.45％，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

取已知蘆丁含量的莓葉委陵菜春季葉片樣品6份，每份1 g，分別精密加入0.41 mg·mL－1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液150μL；取已知兒茶素含量的莓葉委陵菜秋季地下部分樣品6份，每份1 g，分別精密加入0.33 mg·m L－1兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL；按上述樣品溶液制備方法和HPLC色譜條件分別提取測(cè)定，每份樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，檢測(cè)該方法的加樣回收率。樣品溶液中蘆丁的平均回收率為97.10％、RSD為1.96％；兒茶素的平均回收率為96.4％、RSD為1.83％。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DPSV7.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果和分析

春季和秋季莓葉委陵菜葉片和地下部分的蘆丁與兒茶素的平均含量見(jiàn)表1，所有測(cè)定值的RSD均小于3.0％。由表1可見(jiàn)，春季莓葉委陵菜葉片和地下部分的蘆丁含量均顯著高于秋季(P＜0.05)，春季葉片和地下部分的蘆丁含量分別是秋季的2.85和5.08倍。秋季葉片中兒茶素的含量顯著高于春季(P＜0.05)，達(dá)到2.98倍；而秋季地下部分的兒茶素含量則顯著低于春季(P＜0.05)，僅為春季的50.64％。

由表1還可見(jiàn)，不論是春季還是秋季，莓葉委陵菜葉片中的蘆丁含量均顯著高于地下部分(P＜0.05)，春季和秋季葉片中的蘆丁含量分別是地下部分的30.70和54.85倍。莓葉委陵菜各部位兒茶素含量的季節(jié)變化則與蘆丁不同，春季地下部分的兒茶素含量顯著高于葉片(P＜0.05)，是葉片的2.75倍；而秋季地下部分的兒茶素含量則顯著低于葉片(P＜0.05)，僅為葉片的46.72％。

表1 春季和秋季莓葉委陵菜葉片和地下部分蘆丁和兒茶素的含量1) Table 1 Contents of rutin and catechin in leaves and under-ground part of Potentilla fragarioides L.in spring and autumn1)

3 討論和結(jié)論

近年來(lái)，在黃酮類(lèi)成分含量的測(cè)定方法中HPLC方法［12］是比較先進(jìn)的測(cè)定方法之一。因此，作者利用該方法測(cè)定了莓葉委陵菜葉片及地下部分蘆丁和兒茶素2種黃酮類(lèi)成分的含量，并對(duì)這2種成分在春季和秋季的季節(jié)差異進(jìn)行了比較。該方法簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性和線(xiàn)性關(guān)系良好，回收率較高，結(jié)果可靠。

測(cè)定結(jié)果顯示，莓葉委陵菜葉片中的蘆丁含量較地下部分高，尤其是春季葉片的蘆丁含量最高，因此，若以獲取蘆丁單體為目的，從充分利用資源的角度考慮，應(yīng)采集莓葉委陵菜的葉片，特別是春季的葉片。莓葉委陵菜秋季葉片的兒茶素含量最高，因此，若以提取兒茶素單體為目的，從資源利用的角度考慮，應(yīng)采集莓葉委陵菜秋季葉片為宜。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以看出，莓葉委陵菜葉片和地下部分蘆丁與兒茶素含量都比較豐富，其同屬植物委陵菜和翻白草(Potentilla discolor Bunge)的藥用功效已很明確［4，13］，因此，推測(cè)莓葉委陵菜也應(yīng)具有相似的藥用價(jià)值。

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