花燭突變體葉色嵌合性狀的分化特征與保持方法

陳星旭，邵會會，王廣東

（南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095）

花燭（Anthurium andraeanum Lind.）為天南星科（Araceae）多年生常綠草本植物［1］，其葉片、佛焰苞及肉穗花序均具有較高的觀賞價值，因此，既可作為優(yōu)良盆花和切花，還可作為觀葉植物。目前觀葉花燭品種較少，培育觀葉花燭新品種既可以豐富花燭品種，又能滿足市場需求。

葉色嵌合體具有較高的觀賞性，在天南星科其他種類中較為普遍，但在自然條件下花燭葉色嵌合體極少出現(xiàn)。2004年本項目組在進行花燭品種‘Sonate’的離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，由愈傷組織再生的無菌苗中出現(xiàn)1株葉片顏色黃綠相間的葉色嵌合突變株，其表現(xiàn)形式為典型的扇區(qū)型嵌合體（sectorial chimera），其特征為不同遺傳型細胞呈扇區(qū)狀分布于生長點原基不同區(qū)域，從而形成左右相異的“陰陽臉型”。通過腋芽增殖和愈傷組織再生對該嵌合植株進行增殖，獲得了多種性狀的葉色突變株系，并從最初的花葉嵌合株系、黃化株系和深綠色株系中不斷篩選出穩(wěn)定的紅化和白化株系［2］。

花燭葉色嵌合體無論是在離體培養(yǎng)條件下還是移栽后，均有一定比例植株的頂芽失去嵌合性狀，但某些頂芽失去嵌合性狀的植株，其側(cè)芽萌發(fā)后仍能保持原有的葉色嵌合性狀。因此，作者選擇部分頂芽失去嵌合性狀的突變單株進行單芽培養(yǎng)，即將母株切分成若干莖段，每個莖段含1個（或多個）莖節(jié)，然后將切分的莖段接種于培養(yǎng)基上［3］，記錄并分析側(cè)芽再生植株的葉色性狀特征，為進一步研究花燭葉色嵌合體葉色性狀的形成和保持規(guī)律及穩(wěn)定嵌合體的篩選提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以花燭品種‘Sonate’葉色嵌合型無菌苗為實驗材料。由于花燭嵌合體材料較少，生長速度慢，因此僅選擇16個頂芽失去嵌合性狀的單株進行研究。其中，8個單株處于增殖階段，接種于增殖培養(yǎng)基［4］中；另外8個單株長期處于生根階段，接種于生根培養(yǎng)基［5］中。

1.2 方法

將16個單株的莖分別切成小段，每個切段包含1片葉。頂芽和基部保留，一并進行后續(xù)培養(yǎng)。將處于增殖階段單株的切段繼續(xù)接種于增殖培養(yǎng)基上；將處于生根階段單株的小段（包括帶根的基部）繼續(xù)接種于生根培養(yǎng)基上。待側(cè)芽萌發(fā)后，連續(xù)記錄每片新生葉片的葉色性狀，拍照并統(tǒng)計嵌合再生率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別統(tǒng)計增殖和生根階段每個單株的側(cè)芽嵌合再生率及基部再生芽嵌合率，并計算總嵌合再生率。計算公式分別為：側(cè)芽嵌合再生率=（嵌合側(cè)芽數(shù)/側(cè)芽數(shù)）×100％；基部再生芽嵌合率=（嵌合芽數(shù)/再生芽數(shù)）×100％；總嵌合再生率=（嵌合芽總數(shù)/再生芽總數(shù)）×100％。

2 結(jié)果和分析

2.1 處于增殖階段的花燭突變單株葉色嵌合性狀的分化特征及嵌合再生率分析

8個處于增殖階段的花燭突變單株均有一定比例的側(cè)芽具有嵌合性狀，其中1個單株的側(cè)芽再生植株中嵌合性狀的分化特征見圖1。在圖1-1中，Ⅰ切段為植株基部，Ⅵ切段為植株頂芽，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ切段為基部至頂部按順序排列的4個莖段，接種于增殖培養(yǎng)基上2～3個月后均有再生芽形成。Ⅰ切段的再生植株性狀見圖1-2～4，在第4片新生葉邊緣有少量非綠色部分，但該植株是由愈傷組織再生而來（圖1-3），因此，在計算側(cè)芽再生植株的嵌合率時并不將其計入。這種現(xiàn)象在Ⅱ莖段中尤為明顯，Ⅱ莖段的側(cè)芽并未萌發(fā)，而是先在切口處長出一團愈傷組織（圖1-6），然后再由愈傷組織分化出1株具嵌合性狀的植株（圖1-7）。Ⅲ和Ⅳ莖段最初的葉片均為嵌合型葉片（圖1-1中箭頭所示），二者在隨后的培養(yǎng)過程中均分化出具嵌合性狀的植株（圖1-10，13）。但這2個再生植株的第1片葉均不具備嵌合性狀，前者的第2片新生葉（圖1-9箭頭所示）和后者的第3片新生葉（圖1-13箭頭所示）才具有嵌合性狀。Ⅴ莖段的第3片葉邊緣存在少許非綠色部分，但隨后的第4片葉嵌合性狀消失（圖1-16）。Ⅵ切段為頂芽，其再生葉片均為綠色，無嵌合性狀出現(xiàn)（圖1-19）。此單株總計再生植株6株，其中確定為側(cè)芽的4株，側(cè)芽中明顯出現(xiàn)嵌合性狀的2株。

在計算側(cè)芽的嵌合率時對偶然出現(xiàn)且非綠色部分在葉面積中所占比率極小的葉片不予計數(shù)，因此，上述單株的側(cè)芽嵌合再生率為50.0％。按此方法，統(tǒng)計了處于增殖階段的8個單株的側(cè)芽嵌合再生率，統(tǒng)計結(jié)果見表1。

由表1可知：8個單株的側(cè)芽均能再生出具嵌合性狀的植株，且這些側(cè)芽均萌發(fā)于最初即為嵌合葉片的葉腋。供試的8個單株中，側(cè)芽嵌合再生率最高為75.0％、最低為25.0％，處于增殖階段的8個單株的總側(cè)芽嵌合再生率為48.4％。

圖1 處于增殖階段的花燭突變單株再生植株葉色嵌合性狀的分化特征Fig.1 Differentiation characteristics of leaf color chimera feature of regenerated plantlet from mutated plantlet of Anthurium andraeanum Lind.in proliferation phase

表1 處于增殖階段的8個花燭突變單株側(cè)芽嵌合率比較Table1 Comparison of chimera percentage of axillary bud from eight mutated p lantlets of Anthurium andraeanum Lind.in proliferation phase

2.2 處于生根階段的花燭突變單株葉色嵌合性狀的分化特征及嵌合再生率分析

處于生根階段的8個花燭突變單株均有一定比例的側(cè)芽具有嵌合性狀，其中1個單株的側(cè)芽再生植株中嵌合性狀的分化特征見圖2。如圖2-1所示，Ⅰ號為失去嵌合性狀的頂芽，在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了散點綠型葉片（圖2-3）。Ⅱ號為該嵌合單株的基部，在培養(yǎng)過程中從基部萌發(fā)了2個新芽，分別為嵌合型和非綠色型（圖2-4）。該嵌合單株還具有2個萌發(fā)側(cè)芽Ⅲ和Ⅳ（圖2-1），在未進行單芽繁殖前，其中Ⅲ號側(cè)芽在非綠色的一端（圖2-1），為非綠色型；Ⅳ號側(cè)芽在綠色部分的一端（圖2-1），為嵌合型；Ⅲ號側(cè)芽在隨后的培養(yǎng)中一直為非綠色型（圖2-6～8），而Ⅳ號側(cè)芽則一直保持嵌合性狀（圖2-9～11）。

由于本實驗僅統(tǒng)計側(cè)芽嵌合率，因而由頂芽性狀改變重新生成的嵌合型葉片不計入側(cè)芽嵌合再生率；由于植株處于生根階段，此階段的培養(yǎng)基成分與增殖階段不同，不易使莖段切口處出現(xiàn)大量愈傷組織，因此將此階段側(cè)芽再生的新芽全部進行統(tǒng)計記錄；再則，基部短縮莖節(jié)上葉片全部老化脫落，無法進一步分析基部再生芽的葉色性狀與原葉片及母株葉色特征間的關(guān)系，因此未將這類再生芽計入側(cè)芽再生數(shù)，而是作為基部再生芽數(shù)另行統(tǒng)計分析，因此，每個單株的總再生芽數(shù)包括了側(cè)芽與基部再生芽數(shù)。按照前述統(tǒng)計原則，8個處于生根階段的單株的側(cè)芽再生芽及基部再生芽的嵌合狀況的統(tǒng)計結(jié)果見表2。結(jié)果表明：8個單株的側(cè)芽及基部均能萌發(fā)出具嵌合性狀的再生芽，總嵌合再生率分別達到47.8％和64.7％。其中8個單株中側(cè)芽嵌合再生率最高達到66.7％，最低為25.0％；8個單株中基部再生芽嵌合率最高為80.0％、最低33.3％，表明通過側(cè)芽和基部再生芽均可萌發(fā)獲得嵌合體。

圖2 處于生根階段的花燭突變單株再生芽葉色嵌合性狀的分化特征Fig.2 Differentiation characteristics of leaf color chimera feature of regenerated bud from mutated plantlet of Anthurium andraeanum Lind.in rooting phase

表2 處于生根階段的8個花燭突變單株側(cè)芽及基部再生芽的嵌合率比較Table2 Comparison of chimera percentage of regenerated bud from axillary bud and basal part of eight mutated p lantlets of Anthurium andraeanum Lind.in rooting phase

3 討論和結(jié)論

處于增殖和生根2個階段的花燭葉色嵌合體通過側(cè)芽再生總嵌合率分別可達48.4％和47.8％。通過生根階段植株莖基部再生不定芽的方法，總嵌合率則高達64.7％。因此，可以利用現(xiàn)有嵌合植株（不同生長階段皆可）通過側(cè)芽再生（增殖與生根2個階段）或基部再生（生根階段）的方法確保嵌合性狀的持續(xù)出現(xiàn)，其中以基部再生芽嵌合率略高，適于穩(wěn)定嵌合體的篩選。根據(jù)本研究結(jié)果，總結(jié)歸納出花燭突變單株葉色嵌合性狀的保持方法，其流程圖見圖3。

圖3 花燭突變植株葉色嵌合性狀保持流程圖Fig.3 Flow chart of retention of leaf color chimera feature of mutated plantlet of Anthurium andraeanum Lind.

花燭莖節(jié)短縮，不易切成小段進行單芽繁殖培養(yǎng)。但是，供試品種‘Sonate’為切花品種，其莖節(jié)長于其他品種，在增殖培養(yǎng)基中添加了2iP，能夠促使其幼苗莖節(jié)進一步伸長［3-4］，便于在增殖階段進行單芽繁殖操作。在生根階段，幼苗生根、莖加粗、莖節(jié)縮短，且培養(yǎng)時間越長，莖基部莖節(jié)縮短越明顯；而在此階段生長時間較長，且莖節(jié)上又存在休眠芽［6］，因而，處于此階段的植株基部存在較多芽點，切掉基部以上部位后仍可以促使這些芽點萌發(fā)，產(chǎn)生大量再生植株。因而，除可通過側(cè)芽再生培養(yǎng)保持葉色嵌合性狀外，也可通過生根階段莖基部的再生培養(yǎng)保持花燭的葉色嵌合性狀。

植物嵌合性狀若能連續(xù)表現(xiàn)，那么在頂端分生組織中就必然包含突變細胞，且突變細胞能夠在頂端分生組織不斷形成中不被替代［7-9］。同時，在含突變細胞的頂端分生組織形成葉原基的過程中，要確保突變細胞在頂端分生組織的L1、L2和L3層中占有一定的比率，進而在葉原基形成葉片時才能呈現(xiàn)出嵌合性狀［8-9］。側(cè)芽的形成晚于頂芽，側(cè)芽的形成與分化具有特殊之處，即存在傾向于分化成葉片的營養(yǎng)性原基（vegetative primordium）和傾向于重新形成分生組織的生殖性原基（reproductive primordium）的差別［10］?；T葉色嵌合體頂芽失去嵌合性狀后，可以通過側(cè)芽增殖保持嵌合性狀，這說明側(cè)芽原基中部分分生組織細胞中包含突變細胞。分生組織細胞是在側(cè)芽原基的形成過程中確立的，這種重新確立的機制尚不明確，而這一問題的解決將為進一步明確頂端分生組織及側(cè)芽原基的形成和分化機制以及嵌合性狀的傳遞和保持特性提供理論基礎(chǔ)。

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