超臨界CO₂流體萃取巖白菜中巖白菜素的研究

　　摘要：目的：研究超臨界CO流體萃取巖白菜中巖白菜素的最佳工藝。方法：用紫外-可見分光光度計法測定巖白菜素的含量為指標(biāo)，探討了萃取壓力、萃取溫度、乙醇濃度及用量等因素對巖白菜素收率的影響，確定超臨界CO萃取巖白菜中巖白菜素的最佳條件。結(jié)果：在萃取壓力為15MPa，萃取溫度為55℃，分離壓力為6MPa，分離溫度為40℃，乙醇的濃度為70%的條件下所得提取物中巖白菜素的含量最高。結(jié)論：在提取的最佳參數(shù)組合下，提取物中巖白菜素的含量達12.4%，該工藝條件適宜巖白菜素的提取。
　　關(guān)鍵詞：巖白菜；巖白菜素；超臨界二氧化碳萃取
　　中圖分類號：R284.2文獻標(biāo)識碼：A
　　文章編號：1007-2349（2011）03-0060-03
　　巖白菜為虎耳草科巖白菜屬植物巖白菜Bergamapurpurascens（Hook.f.etThoms.）Engl.的干燥根莖，其主要有效成分巖白菜素屬于異香豆精類化合物，具有良好的鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎、護肝、抗病毒和神經(jīng)保護等作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于慢性支氣管炎的治療［1］。
　　超臨界萃取技術(shù)［2~3］是一種集提取和分離為一體，又基本上不用有機溶劑的新技術(shù)。近20年來的研究表明［4~5］超臨界萃取技術(shù)的自身優(yōu)勢主要有：萃取能力強，提取率高；操作溫度低，能較完好地保存中藥有效成分不被破壞，不發(fā)生次生化，適合那些對熱敏感性強、容易氧化分解破壞的成分的提??；CO超臨界流體對物質(zhì)溶解作用有一定的選擇性，除與目標(biāo)物的極性、沸點、分子量等因素密切相關(guān)外，還與超臨界萃取時的溫度、壓力、夾帶劑等關(guān)系密切。本實驗就溫度、壓力及夾帶劑對萃取巖白菜中巖白菜素的影響進行了初步研究。
　　1儀器與試藥
　　1.1儀器超臨界CO萃取設(shè)備（型號：HA221-50-06，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）；紫外-可見分光光度儀（型號：UV-2450，日本島津）；電子分析天平（型號：PercisaXS-125A，瑞士產(chǎn)）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號：BUCHI-R-200，瑞士產(chǎn)）等。
　　1.2試藥甲醇、乙醇（均為分析純），水（去離子水），D-101大孔吸附樹脂（天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂分公司生產(chǎn)），CO氣體（昆明氧氣廠，食品級純度≥99.9%）。巖白菜樣品（同一批次）由本院楊樹德副教授鑒定為虎耳草科巖白菜屬植物巖白菜Bergamapurpurascens（Hook.f.etThoms.）Engl.的干燥根莖，粉碎備用。巖白菜素對照品（供含量測定用，批號：111532—200202）購于中國藥品生物制品檢定所。
　　2方法與結(jié)果
　　2.1標(biāo)準曲線的建立稱量適量巖白菜素對照品置于容量瓶中，加甲醇溶解，以甲醇為空白，在200～800nm波長段掃描，結(jié)果顯示巖白菜素在274nm處有最大吸收，故選274nm作為巖白菜素的測定波長。如圖1所示。
　　2.1.1對照品溶液的配制精密稱量3.0mg巖白菜素對照品置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，得到60μg/mL的巖白菜素對照品溶液。
　　2.1.2巖白菜超臨界CO提取率測定
　　取巖白菜超臨界CO提取物1g用蒸餾水10mL溶解后轉(zhuǎn)移至大孔吸附樹脂柱中，靜置30min后用300mL去離子水洗脫，棄去水洗部分，再用20%乙醇洗脫，收集洗脫液300mL，取洗脫液0.1mL置10mL容量瓶中稀釋搖勻，并定容至刻度，待測。目標(biāo)成分的提取率按下面的公式計算。
　　式中P表示提取率（%），C表示濃度（μg/mL），A表示吸收值，n表示提取液的稀釋倍數(shù)，V表示提取液的體積（mL），W表示巖白菜原料投料量（g）。
　　2.1.3標(biāo)準曲線的制備精密量取60μg/mL的巖白菜素對照品溶液1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、5.5mL分別置10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。分別以甲醇為空白對照（如圖1所示），在274nm波長處測定吸收度。以縱坐標(biāo)作為吸收度，以橫坐標(biāo)作為濃度，制定標(biāo)準曲線，得到標(biāo)準曲線為y=0.02267c-0.00445（r=0.99986）。如圖2所示，結(jié)果表明巖白菜素對照品在9.0～33.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
　　2.2精密度試驗取同一濃度巖白菜素對照品溶液連續(xù)測定5次，測定結(jié)果見表1所示。結(jié)果：RSD=0.202%，表明儀器精密度良好。
　　2.3穩(wěn)定性試驗分別取同一濃度對照品溶液和供試品溶液在0、0.5、1、2、4h時測定濃度，測定結(jié)果見表2，結(jié)果表明在4h內(nèi)溶液穩(wěn)定。
　　2.4加樣回收率取已知濃度萃取物（A：含巖白菜素量）5份，分別精密加入一定量巖白菜素對照品（B），并溶解定容于10mL，適當(dāng)稀釋（取0.1mL置10mL容量瓶中加適量甲醇溶解，定溶至刻度，測定含量，結(jié)果顯示加樣回收率較好。見表3。
　　3結(jié)果
　　3.1單因素下巖白菜素萃取條件研究
　　3.1.1萃取壓力對巖白菜中巖白菜素提取率的影響分別選取壓力為：10、15、20、25、30MPa。其他因素設(shè)定為：萃取溫度45℃，80%乙醇用量300mL，萃取時間1.0h，CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃。分別進行實驗，按2.1.3的純化方法及公式計算巖白菜素的萃取率。見圖3。
　　由圖3可以看出，萃取壓力在10～15MPa之間時，提取率隨著萃取壓力的增加而顯著提高，在15MPa時有最佳得率。超過15MPa后，萃取率逐漸下降。但20MPa時巖白菜素的萃取率比10MPa時高，可以看出選用萃取壓力在10～20MPa進行萃取較為合適。
　　3.1.2萃取壓力對巖白菜中巖白菜素提取率的影響分別設(shè)定溫度為：40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。其他因素設(shè)定為：萃取壓力15MPa，80%乙醇用量300mL，萃取時間1.0h，CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃。分別進行實驗，按2.1.3的純化方法及公式計算出巖白菜素的萃取率。結(jié)果見圖4。
　　圖4萃取溫度對巖白菜素提取率的影響[KH*3]
　　由圖4可以看出，在55℃時萃取效果最佳，但溫度過高可能使流體的密度發(fā)生改變，使被萃取物在其中的溶解度下降，從而使得率減少。因此本實驗選用萃取溫度范圍為50～60℃安排正交。
　　3.1.3乙醇濃度對巖白菜素提取率的影響根據(jù)設(shè)備條件及預(yù)實驗，分別選取乙醇濃度為：60%、70%、80%、90%、100%。其他因素設(shè)定為：萃取壓力15MPa，萃取溫度55℃，乙醇用量300mL，萃取時間1.0h，CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃分別進行實驗，按2.1.3的純化方法及公式計算巖白菜素的萃取率。結(jié)果見圖5。
　　由圖5可以看出，在70%乙醇濃度時萃取效果最佳，但過高或過低都會使得率減少。因此本實驗選用乙醇濃度為65%～75%進行正交設(shè)計。
　　3.1.4乙醇用量對巖白菜素萃取率的影響分別選取乙醇用量為：100、200、300、400、500、600mL。其他因素設(shè)定為：萃取壓力15MPa，萃取溫度55℃，70%乙醇為夾帶劑，萃取時間1.0h，CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃分別進行實驗，按2.1.3的純化方法及公式計算巖白菜素的萃取率。結(jié)果見圖6。
　　
　　由圖6可以看出，在100~500mL范圍內(nèi)，增加夾帶劑乙醇用量可以使得率明顯增加，當(dāng)乙醇用量多于500mL后，萃取效果逐漸不明顯?？紤]提取成本及設(shè)備自身原因，也不宜過多使用夾帶劑，因此固定乙醇用量為500mL進行實驗。
　　3.2正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，固定CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃，乙醇用量500mL及萃取時間1h等5個因素，選取萃取壓力，萃取溫度及乙醇濃度3個因素為變量，每個因素取3個水平進行正交設(shè)計，因素水平表見表4，L9（34）正交試驗結(jié)果見表5，方差分析見表6。
　　由巖白菜素提取率的正交試驗直觀分析可以得知，因素的影響順序為：乙醇濃度>2N3xt6dAzYzYbEWpO++LAA==萃取溫度>萃取壓力。巖白菜較佳的提取工藝組合為：ABC，即濃度為70％的乙醇為夾帶劑，萃取壓力15MPa，萃取溫度55℃。
　　3.3優(yōu)選工藝的驗證實驗為進一步考察上述優(yōu)選工藝的可行性，按上述最佳工藝條件進行驗證實驗，巖白菜素的含量分別為：12.2%，12.4%，12.5%，12.4%，12.7%，平均得率為12.4%，證明該工藝可行。
　　4討論
　　未見采用超臨界二氧化碳流體技術(shù)直接從巖白菜藥材中萃取巖白菜素的報道，相關(guān)文獻［6］也只對萃取結(jié)晶巖白菜素進行了研究，本研究采用超臨界CO流體萃取技術(shù)直接萃取巖白菜中巖白菜素，并通過單因素試驗、正交試驗得出最佳萃取條件為：萃取壓力為15MPa，乙醇濃度為70%，萃取溫度為55℃，其它條件為固定CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃，乙醇用量500mL及萃取時間1h，巖白菜素的提取率經(jīng)紫外測定可達12.4%，較為理想。
　　本研究為民族藥材巖白菜再次開發(fā)利用及提高相關(guān)制劑質(zhì)量提供了一定的參考和幫助。
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