附子總生物堿中烏頭堿\\新烏頭堿\\次烏頭堿在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究*

　　摘要：目的：研究口服附子總生物堿后烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。方法：口服給予大鼠附子總生物堿后，斷尾取血，采用甲醇沉淀冷凍干燥法處理血漿樣品。采用HPLC-MS/MS分析方法檢測(cè)烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的血藥濃度。藥時(shí)數(shù)據(jù)用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)3p97藥代動(dòng)力學(xué)程序計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)建立的用于檢測(cè)大鼠血漿的HPLC-MS/MS分析方法，其靈敏度高、專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，能很好的符合生物樣品分析的要求。烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的藥動(dòng)學(xué)曲線經(jīng)擬合均符合口服給藥的二室模型。烏頭堿主要藥動(dòng)參數(shù)：T1/2α=3.32±1.56min，T1/2β=886.61±242.14min，AUC=86.558±9.462mg?L-1?min-1，Tpeak=6.989±1.546min，Cmax=83.549±10.459ng?mL-1。新烏頭堿主要藥動(dòng)參數(shù)：T1/2α=15.4989±4.8712min，T1/2β=1255.808±684.891min，AUC=297.212±74.642ng?mL-1?min，Tpeak=15.782±7.541min，Cmax=202.983±30.781ng?mL-1。次烏頭堿主要藥動(dòng)參數(shù)：T1/2α=125.482±51.654min，T1/2β=1007.757±349.485min，AUC=241.206±9.147ng?mL-1?min，Tpeak=16.765±5.478min，Cmax=164.302±20.891ng?mL-1。結(jié)論：灌胃給予附子總生物堿后烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿在大鼠體內(nèi)的過(guò)程符合口服二室模型。
　　關(guān)鍵詞：附子；附子總生物堿；烏頭堿；新烏頭堿；次烏頭堿；HPLC-MS/MS；毒代動(dòng)力學(xué)
　　中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
　　文章編號(hào)：1007-2349（2011）03-0049-04
　　烏頭類有毒中藥如川烏、草烏、附子等是中醫(yī)臨床常用的有毒中藥。已有研究表明烏頭類有毒中藥具有強(qiáng)心［1~5］、抗休克［6］、抗心律失常［7］、抗炎鎮(zhèn)痛［8~9］、致心律失常［10］抑制呼吸中樞、興奮迷走中樞等作用，烏頭堿類生物堿如烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿既是烏頭、附子中的主要有毒成分，也是發(fā)揮部分藥效的主要有效成分。近年來(lái)烏頭堿類生物堿的毒理學(xué)研究越來(lái)越深入，如已有文獻(xiàn)報(bào)道了烏頭堿對(duì)結(jié)腸間質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、大鼠胚胎等的影響機(jī)制［11~13］，但體內(nèi)過(guò)程的研究相對(duì)較少。
　　由于烏頭堿類生物堿毒性大，動(dòng)物血漿內(nèi)的含量較低，對(duì)熱不穩(wěn)定，容易發(fā)生水解。有研究發(fā)現(xiàn)烏頭堿在甲醇溶液中不穩(wěn)定，常溫下放置短時(shí)間即可產(chǎn)生新的物質(zhì)［14~15］。故本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高靈敏的HPLC-MS/MS檢測(cè)樣品中烏頭堿類生物堿（烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿）的含量，采用甲醇沉淀凍干法處理血漿樣品，對(duì)口服給予附子總生物堿后烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行研究。
　　1實(shí)驗(yàn)材料
　　1.1實(shí)驗(yàn)儀器API3000質(zhì)譜儀（AB公司）；Dionex高效液相色譜儀；WH-1微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）；TCL-16g型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FD-1B-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；
　　1.2試劑與試藥烏頭堿（Aconitine，A），中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110720-200410；新烏頭堿（Mesaconitine，MA），中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110798-200404；次烏頭堿（Hypaconitine，HA），中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110799-200505；附子雙酯型生物堿，為本課題組化學(xué)組提供，經(jīng)HPLC測(cè)定生物堿含量為：烏頭堿：0.0778mg/mL，新烏頭堿：0.978mg/mL，次烏頭堿：0.3274mg/mL。甲醇為色譜純，三乙胺、二氯甲烷、鹽酸等為分析純，水為雙蒸水。
　　1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雌雄各半，成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：08-049），體重（280±20）g，健康合格，檢疫后備用。
　　2實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1檢測(cè)條件
　　2.1.1高效液相色譜條件色譜柱：PhenomenexGeminiC18，Φ250mm×Φ4.6mm，5μm；預(yù)柱：Phenomenex；ChromGuardHPLCC18Column，Φ4mm×3mm，5μm，流動(dòng)相：甲醇-水-三乙胺=80∶20∶0.1流速：0.6mL?min-1；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL。
　　2.1.2質(zhì)譜條件離子源：ESI，正離子MRM掃描，CUR13.0L?min-1，CAD6.0L?min-1，IS：5500V，TEM：450℃，GS1：33.0L?min-1，GA2：33.0L?min-1，DP：100.0V，F(xiàn)P400.0V，EP：11.0V，CE：60.0V.
　　MRM檢測(cè)：烏頭堿：646.0/586.0，646.0/105.0；次烏頭堿：616.3/338.5；新烏頭堿：632.0/105.0
　　2.2對(duì)照品溶液的配制分別精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品適量，用二氯甲烷制成每1mL含0.135mg，0.104mg和0.132mg的溶液。再取一定量溶液以二氯甲烷稀釋成濃度分別為1.35、1.04和1.32μg/mL的對(duì)照品溶液保存在4℃的避光冰箱中備用。
　　2.3樣品處理方法取血漿樣品200μL置于離心管中，按1∶4的比例加入甲醇800μL，渦旋振蕩3min，沉淀蛋白，按10000r?min-1離心10min，取上清液，加入雙蒸水配成甲醇濃度為20％的溶液，置于凍干瓶中冷凍干燥，于檢測(cè)前向凍干瓶中加入400μL甲醇，旋渦震蕩3min，按10000r?min-1離心5min，取上清液進(jìn)樣測(cè)定。
　　2.4毒代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)取SD大鼠，6只，雌雄各半，體重（280±20）g。灌胃附子總生物堿，折算成烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿劑量為：烏頭堿0.3112mg/kg，新烏頭堿3.912mg/kg，次烏頭堿1.3096mg/kg，灌胃后分別于3、5、10、20、30、60、90、120、240、360、540、720min斷尾取血0.5mL，肝素鈉抗凝，離心后取血漿，按上述“2.3”處理樣品，將處理后樣品按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件測(cè)定樣品。
　　3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　3.1方法專屬性取空白血漿、空白血漿+對(duì)照品、血漿樣品按“2.3”處理，與對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件測(cè)定，考察方法的專屬性。結(jié)果見圖1~3。
　　結(jié)果表明，空白血漿MRM掃描圖中與空白血漿+對(duì)照品和血漿樣品MRM掃描圖比較無(wú)相關(guān)離子檢測(cè)峰存在，說(shuō)明專屬性良好。
　　3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度分別取大鼠空白血漿200μL，加入適當(dāng)?shù)臐舛鹊臑躅^堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品溶液10μL配制成用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的血漿樣品，這些血漿樣品分別按“2.3”方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品在血漿樣品中的濃度（c）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行加權(quán)（1/c2）最小二乘法計(jì)算。結(jié)果表明烏頭堿在27~270ng/mL范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，線性方程為：Y=273.56c-13242.8，r=0.9974，LOD及LOQ分別為4.5、9ng/mL；新烏頭堿在10.4~312ng/mL范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，線性方程為：Y=159.23c-3038.1，r=0.9953，LOD及LOQ分別為5.2、10.4ng/mL；次烏頭堿分別在13.2~132ng/mL和132~518ng/mL范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。線性方程分別為Y=2.1433c+82.304，r=0.9984和Y=10.4033c-614.043，r=0.9963，LOD及LOQ分別為6.6、13.2ng/mL。
　　
　　3.3回收率分別取大鼠空白血漿200μL加入一定量的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品溶液，分別配制成54、27、10.8，62.4、20.8、10.4，396、132、13.2ng/mL濃度的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿血漿樣品，按“2.3”處理后，分別測(cè)試，計(jì)算回收率。烏頭堿的血漿樣品的回收率分別為97.89±2.63％、95.63±3.56％和91.48±5.00％；新烏頭堿的血漿樣品的回收率分別為97.31±2.27％、95.24±3.56％和94.71±3.46％；次烏頭堿的血漿樣品的回收率分別為97.47±3.23％、97.73±3.89％和96.97±5.68％。均符合定量分析的要求。
　　3.4精密度和準(zhǔn)確度分別取大鼠空白血漿200μL加入一定量的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品溶液，分別配制成54、27、10.8、62.4、20.8、10.4、396、132、13.2ng/mL濃度的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿血漿樣品，按“2.3”處理后，分別測(cè)試，進(jìn)行日內(nèi)精密度試驗(yàn)，另外取上述制備好的樣品，間隔時(shí)間做3日內(nèi)的日間精密度試驗(yàn)。烏頭堿：日內(nèi)精密度為3.6％、4.2％、5.5％；日間精密度為2.4％、2.7％、4.5％。新烏頭堿：日內(nèi)精密度為1.9％、4.1％、3.7％；日間精密度為2.4％、3.1％、4.4％。次烏頭堿：日內(nèi)精密度為2.9％、3.1％、2.8％；日間精密度為2.6％、3.3％、4.7％。結(jié)果精密度符合要求，測(cè)定方法可靠。
　　3.5毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)按2.4項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法，分別得到不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度。將藥時(shí)數(shù)據(jù)用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)3p97藥代動(dòng)力學(xué)程序進(jìn)行自動(dòng)擬合處理。以理論血藥濃度值與實(shí)驗(yàn)測(cè)定值的相關(guān)系數(shù)最大和AIC最小作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果：烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的藥動(dòng)學(xué)曲線經(jīng)擬合均符合口服給藥的二室模型，藥物濃度-時(shí)間曲線見圖4，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。將烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿按時(shí)間點(diǎn)繪制藥-時(shí)曲線圖，對(duì)比體內(nèi)代謝的變化，見圖7。
　　4討論
　　研究表明，在灌胃給藥后10min，烏頭堿即達(dá)最高血藥濃度，此后血藥濃度快速下降，在30min下降到10min的一半左右，此后在60、360min出現(xiàn)了多峰。在灌胃給藥后20min，新烏頭堿即達(dá)最高血藥濃度，此后血藥濃度總體緩緩下降，但在90、360min出現(xiàn)了多峰。在灌胃給藥后20min，次烏頭堿即達(dá)最高血藥濃度，此后血藥濃度快速下降，在30min下降到20min的一半左右，此后在60、120min出現(xiàn)了多峰。提示烏頭堿類雙酯型生物堿口服后吸收很快入血，且分布迅速，然后出現(xiàn)多峰現(xiàn)象，血藥濃度緩慢下降。
　　因?yàn)闉躅^堿類雙酯型生物堿毒性、藥效相似，故將新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿同一時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度相加，繪制藥時(shí)曲線，觀察大鼠口服烏頭堿類雙酯型生物堿后總濃度在血液中的動(dòng)態(tài)變化（見圖5）。
　　結(jié)果表明：在灌胃給藥后20min，烏頭堿類雙酯型生物堿總血藥濃度達(dá)最高，此后血藥濃度快速下降，在30min下降到20min的3/4左右，此后在60、120、240min出現(xiàn)了多峰?？傮w趨勢(shì)是30~360min血藥濃度相對(duì)穩(wěn)定，然后呈緩緩下降趨勢(shì)。提示大鼠口服附子總生物堿后，吸收迅速，然后快速分布，30~360min保持相對(duì)穩(wěn)定血藥濃度，而后血藥濃度呈緩緩下降趨勢(shì)。
　　預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超過(guò)本研究所用給藥劑量，多數(shù)動(dòng)物在30min之內(nèi)死亡，死亡前出現(xiàn)喘息、唾液分泌過(guò)多、鼻分泌物增多，尿失禁現(xiàn)象。死亡后解剖動(dòng)物，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)肝臟呈黑紫色，肺表面出現(xiàn)大量出血點(diǎn)。按以上劑量給藥，動(dòng)物雖然不致死亡，但在15min左右出現(xiàn)了喘息、呼吸頻率減慢、鼻分泌物增多、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、異常運(yùn)動(dòng)、俯臥、震顫，尿失禁，唾液分泌過(guò)多、流涎等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象在30min后逐漸得到緩解，呼吸漸趨正常，自主活動(dòng)也較前嚴(yán)重中毒時(shí)增加但仍有中毒的反應(yīng)存在。
　　[KH*3D][XC20110307.tif;%100%110][HT6H]
　　圖60~30min總生物堿藥-時(shí)曲線圖[KH*3]
　　觀察烏頭類有毒中藥生物堿30min內(nèi)的藥-時(shí)曲線（見圖6），可見烏頭類有毒中藥生物堿總量在20min內(nèi)快速上升，然后快速下降，特別是烏頭堿和次烏頭堿表現(xiàn)更為明顯。提示動(dòng)物在30min內(nèi)出現(xiàn)的中毒反應(yīng)與烏頭類有毒中藥生物堿總量的血藥濃度快速上升有關(guān)，而30min后逐漸緩解與其血藥濃度快速下降有關(guān)。其后烏頭類有毒中藥生物堿總量的血藥濃度出現(xiàn)多峰現(xiàn)象，并在一定范圍內(nèi)相對(duì)平穩(wěn)，使動(dòng)物在一段時(shí)間內(nèi)保持輕度中毒的狀態(tài)。證實(shí)了烏頭類有毒中藥生物堿的血藥濃度與中毒反應(yīng)的產(chǎn)生具有直接相關(guān)性。
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