揭秘化妝品安全性評價技術(六)

　　日用化工產(chǎn)品通常引起刺激性皮炎、色素沉著和變態(tài)反應性皮炎等皮膚疾病，在化妝品所引起的病例中占到了95％以上。因此，皮膚刺激／腐蝕試驗是化妝品總體安全評價程序的一部分，特別是對于可能引起皮膚刺激或腐蝕作用的化妝品特殊組份，進行皮膚刺激／腐蝕試驗十分必要。世界各國都把化妝品及其原料的皮膚刺激／腐蝕試驗列為化妝品安全評價的檢測內(nèi)容。
　　
　　一、化妝品的局部皮膚毒性反應
　　
　　皮膚暴露于外源物質(zhì)(包括化學品、藥物或化妝品)可引起多種皮膚反應，反應早期通常是因皮膚屏障功能破壞而出現(xiàn)的皮膚干燥(水分失丟)，然后形成紅斑和水腫為特征的皮膚刺激反應；還有一部分是由于過敏導致的接觸過敏和色素沉著。據(jù)報道，職業(yè)因素和化妝品引起的皮膚病中接觸性皮炎約占90％以上，其中全部接觸性皮炎病例中約70％為皮膚刺激性反應。臨床上引起兩種不同類型的炎癥反應過程：刺激性和變態(tài)反應性皮炎。通常皮膚接觸化學物質(zhì)后，可觀察和辨別到幾種非免疫性的反應形式：
　　皮膚刺激性是指皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部可逆性損傷，皮膚刺激反應一般無免疫系統(tǒng)的參與，其典型表現(xiàn)是紅斑或水腫。皮膚腐蝕性指的是不可逆損傷，典型表現(xiàn)是潰瘍、出血和血痂，以及由于皮膚漂白出現(xiàn)的脫色、脫發(fā)和疤痕。國際法規(guī)強制要求化學品上市前必須進行皮膚腐蝕性評價。但是腐蝕性并不是化妝品使用中希望發(fā)生的現(xiàn)象，只是由于制造商失誤或消費者誤用的情況下偶然發(fā)生的情況。另一方面，化妝品原料也可能本身具有腐蝕性，但在化妝品中并不排斥使用，因此終產(chǎn)品腐蝕性的大小與下列因素密切相關：化妝品中腐蝕物質(zhì)的終濃度、中和物質(zhì)的有無、賦形劑的使用、暴露途徑以及使用條件等。
　　累積性刺激是重復暴露于外源物質(zhì)發(fā)生的可逆刺激反應，接觸此類物質(zhì)引起的皮膚變化較緩慢，如皮膚增厚、皺紋產(chǎn)生和色素沉著等，這些變化是皮膚炎癥的間接效應。
　　
　　二、體內(nèi)動物實驗
　　
　　傳統(tǒng)皮膚刺激和腐蝕試驗多采用動物進行。單次體內(nèi)皮膚刺激試驗一般用兔進行，每次試驗至少選擇4只健康的成年動物。如預期有刺激反應，初試應考慮使用1只動物。如沒有出現(xiàn)明顯的陽性反應(紅斑或水腫記分大于2)時，應至少再使用2只動物進行試驗。如預期無反應，初試可使用3只動物。在使用了至少3只動物后，如仍為疑似反應或不明確，應考慮進行復試。
　　多次體內(nèi)皮膚刺激試驗是指在7～14天內(nèi)對實驗動物進行重復皮膚染毒，對檢測化妝品刺激性的效果比單次染毒效果好，特別適用于與皮膚長期密切接觸的或反復使用的個人護理產(chǎn)品。每次試驗選擇三組以上的動物，每組動物雌雄各5～10只，各組分別接受不同劑量的受試物進行測試。根據(jù)產(chǎn)品的性質(zhì)和用途，多次皮膚刺激試驗進行染毒程序、方式和次數(shù)的調(diào)整。
　　體內(nèi)皮膚腐蝕試驗與刺激試驗采用同一試驗程序，不同之處在于動物反應程度的差異。對于預期具有腐蝕性的受試物，強烈建議只用一只動物進行初次試驗。先后施用共3次斑貼，第一次斑貼在貼敷3min后去除。如果未觀察到嚴重皮膚反應，則在不同的位點施用第二次斑貼，1h后去除。如果此時觀察的結果表明動物能夠忍受第三次暴露造成的痛苦，則第三次應在4h后去除斑貼。記錄每個時間點的反應程度。如果在連續(xù)的3次暴露后的任何一次觀察到腐蝕效應(如潰瘍、出血)，則試驗立即終止，如果最后一次斑貼去除后，仍未觀察到腐蝕效應，動物應觀察到14天。
　　為了提高皮膚評價試驗的科學性，更好的體現(xiàn)3R原則，2002年版的OECD指南對皮膚刺激性的動物試驗的有關條款進行了優(yōu)化，采用新的試驗策略，可以避免和減少不必要的動物皮膚刺激／腐蝕試驗。這一策略基于如下階梯式順序：現(xiàn)有資料分析，pH值測定，使用經(jīng)驗證和接受的體外方法，最后進行對動物試驗優(yōu)化。在下列4種情況下，可不考慮進行皮膚腐蝕試驗：①根據(jù)結構與活性關系或理化特性推斷可能具有皮膚腐蝕性的物質(zhì)，如強堿或強酸類，pH≤2.0或pH≥11.5；②經(jīng)急性經(jīng)皮毒性試驗顯示具有很強系統(tǒng)毒性的物質(zhì)；③經(jīng)腐蝕性試驗的替代試驗(如TER法、皮膚模型試驗)的其中一種方法證明具有腐蝕性的物質(zhì)；④急性經(jīng)皮毒性試驗中，染毒劑量達2000mg／kg時仍未產(chǎn)生皮膚刺激體征的物質(zhì)。對于非腐蝕性物質(zhì)也只有必要時才進行體內(nèi)皮膚刺激試驗。
　　
　　三、體內(nèi)人體皮膚刺激試驗
　　
　　人體皮膚貼斑試驗包括單次、多次和加強暴露刺激試驗等多種，其目的是檢測受試物引起人體不良反應的可能性。人體試驗一般是用來決定產(chǎn)品或配方的“皮膚相對兼容性”和進行局部“暴露”的風險評價，以證明這種物質(zhì)應用于化妝品中第一次接觸人皮膚或粘膜時對人體無損害。然而，如果只是為了危害評估，化妝品人體志愿者測試獲得的數(shù)據(jù)存在一些特定的偶然性。
　　單次刺激斑貼試驗是評價化妝品對皮膚刺激性的經(jīng)典方法之一，通常采用芬蘭斑試器(Finn chamber)或不同直徑的Hilltop斑試器。實驗方法有局部全封閉斑貼法和局部半封閉斑貼法，區(qū)別在于前者完全不透氣，后者使用半封閉敷料固定，接觸時間通常為24～48h?？筛鶕?jù)實際情況進行調(diào)整。
　　對于使用頻繁的化妝品多次刺激貼斑試驗更有價值，因為某些化學物接觸皮膚一次不產(chǎn)生刺激反應，但接觸皮膚多次卻可能引發(fā)強烈的刺激反應。多次斑貼試驗可評估化妝品是否會引起累積性刺激反應或變應性接觸性皮炎?？筛鶕?jù)產(chǎn)品用途在指南原則下調(diào)整產(chǎn)品的皮膚接觸時間、涂抹劑量、間隔時間和重復接觸次數(shù)。
　　除了上述常規(guī)的皮膚斑貼試驗外，還有幾種改進的試驗方法用于特殊用途化妝品的檢測。皮膚劃痕試驗是一種用受損皮膚評估化妝品刺激反應的方法，肥皂小室試驗專門用來研究肥皂是否導致皮膚干裂和剝落的一種試驗，彎曲洗滌試驗或肘關節(jié)彎曲洗滌試驗主要應用于評估肥皂和去污劑接觸人體皮膚產(chǎn)生刺激反應的情況。這些試驗方法在產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)控和檢驗評估過程中都有被應用。
　　人體志愿者的斑貼試驗與體內(nèi)動物實驗的觀察和分級是類似的，也包括紅斑、水腫、水皰和焦痂等反應，具體分級及評估法可參考有關標準。除了主觀性較強的肉眼評判外，還可借助檢測儀器提高結果評價的客觀性，如經(jīng)皮膚水分流失(TEWL)和皮膚水份含量等。
　　志愿者的測試實際上是一種小樣本的人群流行病學調(diào)查，因而其結果用于預測化妝品應用到普通人群的情況存在不足，除了樣本量的限制，對實驗條件的控制也存在一定的難度，包括不同受試個體的皮膚可能存在差異、試驗時使用的封閉涂抹條件與產(chǎn)品實際使用存在差異、不同試驗環(huán)境條件存在差異等。
　　
　　四、已認可的皮膚刺激試驗體外方法
　　
　　經(jīng)過近20年的皮膚刺激試驗體外替代方法的研究，目前，經(jīng)過驗證和認可的體外方法主要是人工皮膚模型法，該方法于2010年經(jīng)OECD認可為指南439。
　　
　　1、EpiSkin模型試驗
　　EpiSkin是一種三維人體皮膚模型，由法國里昂的EPISKIN-SNC公司開發(fā)。用于替代皮膚刺激試驗時，直接將測試物質(zhì)局部應用于皮膚表面，然后用MTT法評價測試物對細胞活性的作用，以百分比細胞活性為檢測終點用于區(qū)分皮膚刺激物和非刺激物。商品化的皮膚刺激檢測試劑盒含培養(yǎng)基、試劑和12個表皮單位，表皮單位由具有屏障功能的重建表皮組成?？梢詸z測所有劑型的化學物質(zhì)，包括粉劑、液體、分散劑等。將受試化妝品(10uL，mg)涂抹于人工皮膚表面，作用30min后，去除受試物，繼續(xù)孵育42小時，用MTT法測試細胞存活率，必要時輔以IL-1α測定。判斷標準：與對照組相比細胞活性>50％表明受試物無刺激性，細胞活性≤50％，表明受試物具有刺激性。
　　
　　2、EpiDerm^TM模型試驗
　　EpiDerm重建皮膚模型，由位于美國馬里蘭州阿什蘭德的MatTek公司研發(fā)并生產(chǎn)。EpiDerm皮膚模型由來源于人皮膚的角質(zhì)細胞生長于特殊制備的Millicell細胞嵌入培養(yǎng)板中，形成多層分化的人類表皮模型，模型由基底層、棘層、顆粒層和角化層組成，與體內(nèi)皮膚結構類似。以EPI-200為例，試劑盒含24塊人工皮膚組織，培養(yǎng)10天的人工皮膚以特殊制備的嵌入板為支持物，嵌入板包埋于含營養(yǎng)液的瓊脂糖凝膠中便于運輸，試劑盒還包括維持培養(yǎng)基和MTT檢測成分。早期的判定方案是通過測定ET5值(接觸化合物后使組織活性下降50％所需的暴露時間)，通過與陽性對照相比來評估評估化合物的刺激性和非刺激性。后來，采納了與EpiSkin類似的方案，即與陰性對照組相比，細胞活性<50％表明受試物具有刺激性。
　　
　　3、SkinEthi^TM模型試驗
　　Skinethic是由位于法國尼斯的SkinEthic公司開發(fā)的人工皮膚模型。采用無血清培養(yǎng)基制備，制備過程是由培養(yǎng)人正常角質(zhì)細胞于聚碳酸酯嵌入培養(yǎng)板，經(jīng)氣一液界面培養(yǎng)17天完全分化形成表皮結構。產(chǎn)品的質(zhì)量控制，包括組織學觀察和組織活性測定(MTT試驗)，如果OD值大于0.8，且組織學觀察切片顯示至少4層活性細胞層。已提出基于該方法的二步法急性和累積性刺激篩選系統(tǒng)，受試物作用30min后，去除受試物，再孵育42h檢測組織活性，如果細胞活性<50％表明受試物具有刺激性。如果增加IL-1釋放和形態(tài)學改變作為檢測終點可提高檢測的敏感性。
　　
　　五、已認可的皮膚腐蝕試驗的替代方法
　　
　　皮膚腐蝕試驗體外方法的前驗證研究始于1994，經(jīng)過10多年的努力，到2004年，國際社會基本接受的皮膚腐蝕試驗的體外方法，主要有3項，分別是大鼠經(jīng)皮電阻試驗(TER)、CORROSITEX測試和人工皮膚模型試驗(Episkin試驗和EpiDerm試驗)。
　　
　　1、人工皮膚模型試驗
　　體外重建皮膚模型EpiSkin是在膠原蛋白支持物上用人角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)的一種多層人體皮膚模。將受試物直接與EpiSkinI^TM模型作用3、60和240min 3個時間，用MTT法檢測受試物對細胞存活率的影響，陽性對照為冰醋酸或KOH，陰性對照為生理鹽水。陰性對照的細胞相對活性設定為100％，每一樣品測得的OD值與陰性對照相比，求出樣品的細胞相對活性百分比，根據(jù)以下標準進行判定：受試物作用3min后，皮膚細胞活性≤35％，判定為EUR35類；受試物作用3min后，皮膚細胞活性≥35％，作用1h后細胞活性<35％，判定為R34類；受試物作用4h后，皮膚細胞活性≥35％，結論為沒有腐蝕性。
　　皮膚模型EpiDerm是用正常人表皮角質(zhì)形成細胞(NHK)培養(yǎng)而成的一種多層皮膚模型，它包含基底層、棘層、微粒層和一層內(nèi)含細胞間脂質(zhì)的角質(zhì)層。將受試物加在皮膚模型上3min～1h，然后用MTT法測定受試物的細胞毒性。暴露時間為3min和1h。陽性對照為冰醋酸或KOH，陰性對照為生理鹽水。陰性對照的細胞相對活性設定為100％，每一樣品測得的OD值與陰性對照相比，求出樣品的細胞相對活性百分比，根據(jù)腐蝕性判定標準判斷受試物是否具有腐蝕性。EpiDerm^TM模型的腐蝕性判定標準為：①受試物具有腐蝕性：受試物作用3min后，皮膚細胞活性<50％；或受試物作用3min后，皮膚細胞活性≥50％，而且作用1h后細胞活性<15％。②受試物沒有腐蝕性：受試物作用3min后，皮膚細胞活性I≥50％，而且作用1h后細胞活性≥15％。
　　
　　2、大鼠皮膚經(jīng)皮電阻試驗
　　以經(jīng)皮電阻值為檢測終點，通過檢測受試物對大鼠離體皮膚角質(zhì)層完整性和屏障功能的損害能力，評定受試物的腐蝕性。選用28～30天齡的wister大鼠的背部皮膚制作皮膚薄片。將其固定于PTFE管的末端，另一端連接電極。直接涂抹受試物與皮膚薄片作用24h后，去除受試物，用電極測量經(jīng)皮電阻。陽性對照用HCL溶液，陰性對照選用蒸餾水。經(jīng)皮電阻值>5kΩ，評定該受試物無腐蝕性；如經(jīng)皮電阻≤5kΩ，而且該受試物不是表面活性物質(zhì)或中性有機溶劑，評定受試物具有腐蝕性；如果受試物為表面活性物質(zhì)或中性有機溶劑，經(jīng)皮電阻≤5kΩ，可增加硫丹明B染色劑穿透試驗，以確定是否出現(xiàn)假陽性。
　　
　　3、CORROSITEXTM皮膚腐蝕試驗
　　CORROSITEX試驗體系由人造的大分子生物膜和檢測系統(tǒng)(CDS)兩部分組成。蛋白大分子水凝膠生物膜模擬皮膚的正常功能，假定腐蝕性物質(zhì)作用于生物膜與作用于活體皮膚的機制相似，將受試物作用于人工膜屏障的表面，檢測由腐蝕性受試物引起的膜屏障損傷。通過多種方法檢測膜屏障的滲透性，包括pH指示劑顏色的改變和指示劑溶液其它特性的改變。受試物開始作用于膜屏障到膜屏障滲透改變之間經(jīng)過的時間(以min計)作為受試物腐蝕性分類和UN化學品包裝分類(如果適用)的依據(jù)。對每一個試驗方法，都有三種腐蝕性分類的截止時間值。根據(jù)截止時間對受試物腐蝕性的判定應當使腐蝕性危害最小化，即減少假陰性結果的出現(xiàn)。Corrositex最早由美國運輸部認可用于危害化學物分類，ICCVAM認可其對酸、堿衍生物，以及以其為主要成份的配方的檢測。該方法已經(jīng)過驗證，并被推薦為評估化學品皮膚腐蝕性危害分級測試策略的一部分。
　　
　　六、未認可的體外皮膚刺激/腐蝕試驗方法
　　
　　1、離體皮膚模型試驗
　　利用離體兔、人類或豬皮皮膚進行化學物質(zhì)的局部皮膚毒性試驗，試驗采用嵌入式培養(yǎng)模型，檢測終點采用MTT法，通過定量測定受試物作用皮膚不同時間后的效應，可用于區(qū)分急性和遲發(fā)性毒性作用，延長培養(yǎng)時間至7天，還可以區(qū)分化學品的不可逆的有害作用。離體皮膚可來自兔、豬或人，制備方法見第三節(jié)，將制備好的離體皮膚模型，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，更換新的培養(yǎng)液。測試化合物局部涂抹于皮片表面，作用4小時。除去測試化合物后，分別于0、24和48小時檢測MTT。此外，根據(jù)實驗目的，還可檢測表皮細胞的增殖、中性紅攝取和羥基脂肪酸釋放。
　　
　　2、非灌注豬耳試驗
　　將豬耳暴露于試驗物質(zhì)，通過檢測皮膚表面跨表皮水份丟失(TEWL)的絕對增加值，可用于區(qū)分受試物的刺激性和非刺激性。如果TEWL值大于6g／m2／h，則評定受試物具有刺激性。該方法在進行Ⅰ期和Ⅱ期驗證的時候效果并不是特別的好，經(jīng)改進后進入Ⅲ期，所得結果的變異太大，目前試驗方案仍在改進中。
　　
　　3、小鼠皮膚完整性功能試驗
　　將小鼠皮膚暴露于受試物一段時間后，用2種方法用于評估角質(zhì)層的完整性，即跨表皮水分丟失(TEWL)和經(jīng)皮電阻(ER)。SIFT預測模型的基礎是比較應用測試物前后TEWL或ER的值，以大于或小于5倍說明測試物有或無刺激性。使用時，將受試物涂抹于小鼠完整皮膚上，作用一段時間后，測定接觸受試物TEWL和電阻(ER)的大小，按下列公式計算TEWL比值和ER比值，評定受試物是否具有刺激性。正常小鼠完整皮膚模型的TEWL值為3～10(g／m²)，ER值為5～20kΩ。
　　
　　4、結構－活性關系
　　化合物的皮膚刺激或腐蝕性反應的發(fā)生與其特定的化學功能基團或其分子結構直接相關，通過建立已知的皮膚刺激性／腐蝕性物質(zhì)與其分子結構的可測量的參數(shù)之間的相互聯(lián)系的模型，可將某一未知毒性反應終點的化學物的分子結構與之進行比較來預測未知化學物的反應終點。例如，通過對已知腐蝕性和非腐蝕性的酸、堿、親電子試劑和某些中性有機物進行分析，提出了皮膚腐蝕性的QSAR模型。有的模型分析了不同種類的一組有機化合物，根據(jù)其熔點(Mpt)和分子重量(MW)，按照以下的預測模型(PM)可以預測為腐蝕物或非腐蝕物，如果Mpt≥37℃且MW≤123g／mol，預測為皮膚腐蝕物，否則預測為非腐蝕物。
　　
　　結語
　　
　　化妝品皮膚腐蝕的替代方法已被驗證和被EU和OECD法規(guī)接受，所以從這一點上，動物試驗是不能再進行了。皮膚刺激性的體外方法已通過驗證，并正式列入OECD指南草案，有望在2年內(nèi)正式發(fā)布成為新的試驗指南?；瘖y品皮膚刺激性／腐蝕性的危害識別(或分類和標識)應采用逐層的策略，第一層是通過QSAR模型或?qū)＜蚁到y(tǒng)預測皮膚的刺激性／腐蝕性，然后基于pH測試和現(xiàn)有的皮膚吸收或急性毒性的數(shù)據(jù)，第二層是采用已驗證的替代試驗(大鼠皮膚TER檢測、人體皮膚模型試驗、CORROSITEX)或其它允許使用的體外方法，其結果可作為皮膚刺激性或腐蝕性的判定依據(jù)。上述試驗為陰性的物質(zhì)，必要時可進入第三層，進行4小時人體皮膚斑貼試驗。因此，現(xiàn)有的體外方法可以完全替代動物測試，不僅可用于化妝品研發(fā)過程中原料和成品配方的日常評估，還可應用于法規(guī)監(jiān)管目的。
　　致謝：本項目得到廣東省科技攻關項目的資助(20098060300013)
　　
　　編輯／