三七總皂苷對(duì)肺纖維化大鼠的Smad 2/3表達(dá)的影響

　　摘 要：目的：觀察三七總皂苷對(duì)肺纖維化大鼠smad 2/3表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法：56 只 SD 大鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、三七總皂苷組、地塞米松組。采用博萊霉素制備肺纖維化大鼠模型，24 h 后給予干預(yù)藥物，分別于 14 d、28 d處死動(dòng)物后觀察其病理變化、肺系數(shù)及Smad 2/3的表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，三七總皂苷組的肺泡炎和肺纖維化明顯減輕，肺組織Smad 2/3表達(dá)降低。結(jié)論：三七總皂苷抑制博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的機(jī)制與其抑制Smad 2/3蛋白有關(guān)。
　　關(guān)鍵詞：三七總皂苷；Smad 2/3蛋白；博萊霉素；肺纖維化
　　中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
　　文章編號(hào)：1007-2349（2011）05-0065-02
　　
　　肺纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）疾病是各種不同病因肺部疾病的共同結(jié)局，包括特發(fā)性肺纖維化、結(jié)節(jié)病、塵肺、過(guò)敏性肺炎、藥物和放射線導(dǎo)致的纖維化，與膠原血管病有關(guān)的致纖維化肺泡炎等，病因各異，疾病譜廣泛。目前有研究顯示三七總皂苷對(duì)肝纖維化有一定干預(yù)作用^［1］。本研究采用博萊霉素制備肺纖維化大鼠模型，以Smad2/3為靶點(diǎn)，觀察其肺纖維化組織中的表達(dá)，有助于揭示肺纖維化的發(fā)病機(jī)制以及指導(dǎo)臨床防治。
　　1 材料與方法
　　1.1 動(dòng)物來(lái)源 健康雄性SD大鼠56只，體重 200 ±20 g，購(gòu)于昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 ，合格證號(hào)：0010295。
　　1.2 藥物與試劑 博萊霉素：15mg/支，日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)；三七總皂苷（絡(luò)泰注射用血塞通）由昆明制藥集團(tuán)有限公司提供；Smad 2/3試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司；DAB顯色試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。
　　1.3 動(dòng)物模型的建立及分組 將大鼠隨機(jī)分為模型組（MG）、對(duì)照組（CG）、三七總皂苷組（PG）、地塞米松組（DG），每組 14 只。除對(duì)照組外，其他3組大鼠均按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法，經(jīng)氣管一次性注入博萊霉素A5（5mg/kg體重）復(fù)制肺纖維化大鼠模型。對(duì)照組以生理鹽水代替博萊霉素。術(shù)后置動(dòng)物于干燥、溫暖條件下喂養(yǎng)，定期消毒喂養(yǎng)場(chǎng)所。模型建立24 h 后腹腔內(nèi)注射干預(yù)藥物，每日1次，PG為三七總皂苷100mg/ kg?d，DG為地塞米松1 mg/ kg?d，MG則為0.9%氯化鈉注射液0.4 mL/d。
　　1.4 標(biāo)本的采集 各組大鼠分別于手術(shù)后第14 d和28 d各處死7只。大鼠稱重后麻醉，剖胸取肺并稱重，取左下肺葉固定于10%的福爾馬林溶液中，供HE染色和免疫組化檢測(cè)用。
　　1.5 檢測(cè)指標(biāo) （1）一般情況觀察。（2）病理組織學(xué)檢查：HE染色。（3）smad 2/3蛋白測(cè)定：普通光鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)低倍視野，胞漿呈清晰棕色為陽(yáng)性。按染色結(jié)果分為：0級(jí)陰性（-），1級(jí)灶狀陽(yáng)性（+），2級(jí)彌漫性弱陽(yáng)性（++），3級(jí)彌漫性中等陽(yáng)性（+++），4級(jí)彌漫性強(qiáng)陽(yáng)性（++++）。
　　1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。
　　2 結(jié)果
　　2.1 一般狀況觀察 大鼠在術(shù)后第1 d，精神萎靡，活動(dòng)減少，飲食差，第2 d恢復(fù)。CG、PG精神、飲食好，毛色潤(rùn)澤，反應(yīng)靈敏，體重進(jìn)行性增加，無(wú)死亡。DG造模7 d后死亡3只，均于夜間死亡，死亡原因?yàn)榛ハ嗨灰В? d后大鼠精神、飲食、活動(dòng)明顯較以上2組差，體重呈下降趨勢(shì)。MG 14 d后一般情況變差，體重?zé)o明顯增長(zhǎng)，其間死亡1只。
　　2.2 病理學(xué)觀察 MG第14 d肺泡炎癥，成纖維細(xì)胞增生，有膠原沉積及斑片狀的纖維化改變；第28 d炎癥細(xì)胞減少，病變范圍彌散，大量肺泡結(jié)構(gòu)萎陷、破壞，大量膠原沉積在新生的毛細(xì)血管周圍，肺泡間隔以及部分肺泡腔被膠原和纖維蛋白占據(jù)（見圖1）。PG、DG 14 d肺泡炎癥較好轉(zhuǎn)，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞少量增生；第28 d肺泡炎癥消退，少量肺泡結(jié)構(gòu)萎陷，肺泡間隔少量膠原沉積（見圖2）。
　　2.3 smad 2/3蛋白測(cè)定 CG大鼠肺組織僅見smad 2/3少量表達(dá)。MG可見smad 2/3廣泛表達(dá)于肺組織細(xì)胞胞漿和胞核（見圖3）。14 d和28 d均強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，有顯著性差異（P<0.05）。 PG、DG smad 2/3蛋白表達(dá)趨勢(shì)同MG（見圖4），但低于MG，高于CG，差異有顯著性意義（P<0.05）（見表1）。
　　注：與CG比較，*P<0.05；與MG比較，#P<0.05
　　3 討論
　　PF的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，細(xì)胞因子在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，它們構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)分子的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)和鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致以炎細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維母細(xì)胞增生和間質(zhì)結(jié)締組織沉積為特征的免疫介導(dǎo)的慢性炎癥^［2］。Smad家族蛋白是細(xì)胞因子受體的胞內(nèi)激酶底物，介導(dǎo)了TGF-β1對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控^［3］。三七總皂苷具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，改善肺部微循環(huán)；抑制炎性細(xì)胞的滲出與趨化，減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放；抑制肺成纖維細(xì)胞增殖，減少膠原的合成；增強(qiáng)膠原酶活性，促進(jìn)已合成的膠原的降解，從而達(dá)到抑制肺纖維化的作用^［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)氣管注入博萊霉素造模后，MG一般情況變差，病理呈肺纖維化改變，smad 2/3廣泛表達(dá)于肺組織細(xì)胞胞漿和胞核，14 d和28 d均強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。PG、DG大鼠肺組織炎癥及肺纖維化程度均好于MG，但低于CG。而smad 2/3蛋白表達(dá)趨勢(shì)同MG，但低于MG，高于CG。說(shuō)明三七總皂苷和地塞米松對(duì)肺纖維化有一定干預(yù)作用，能延緩肺纖維化發(fā)生，但不能治愈。但DG，死亡率高，副作用大，不宜于長(zhǎng)期使用。
　　綜上所述，三七總皂苷可在一定程度上干預(yù)肺纖維化進(jìn)程，其干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化機(jī)制與抑制Smad 2/3蛋白表達(dá)有關(guān)。Smad 2/3是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性因子。因此，Smad 2/3及其家族作為抗纖維化機(jī)制中的重要靶點(diǎn)，可進(jìn)一步研究。
　　
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