高效液相色譜法測定甘藍中多菌靈殘留

紀淑娟于基成高 興，郭乃菲，

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.大連民族學院生命科學學院，遼寧 大連 116600）

高效液相色譜法測定甘藍中多菌靈殘留

紀淑娟1于基成2高 興1，2郭乃菲1，2

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.大連民族學院生命科學學院，遼寧 大連 116600）

建立一種測定甘藍中多菌靈殘留量的高效液相色譜分析法。甘藍樣品經(jīng)乙腈提取，弗洛里硅土固相萃取柱凈化后，經(jīng)C18色譜柱分離，以V（甲醇）∶V（水）＝7∶3為流動相，在0.3mL/min條件下洗脫，于286nm波長下用紫外檢測器進行檢測。結(jié)果表明，多菌靈峰面積與其濃度呈良好線性關(guān)系，最 低 檢 出 限 可 達 0.008mg/L，回 收 率 為 84.8% ～89.4%，相對標準偏差低于2.7%。

高效液相色譜；甘藍；多菌靈；殘留

甘藍（brassinca oleracea var.capitata）又名結(jié)球甘藍、洋白菜、卷心菜等，為十字花科，1年或2年生草本植物。以葉球供食，可炒、煮、涼拌、腌漬或制成干菜。世界各地普遍栽培，為歐洲、美洲國家的主要蔬菜，中國各地均有栽培。

多菌靈（carbendazim）屬于苯并咪唑類殺菌劑，是一種廣譜、高效、低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，持效期較長［1－2］。該類殺菌劑廣泛應(yīng)用于水果等多種作物的生長期和儲存期，可防治真菌性病害，也可用于防治麥類赤霉病、水稻紋枯病、稻瘟病以及許多蔬菜類病害，如軟腐病、黑腐病等，并具有預防和治療作用。但若使用不當，則會在果蔬產(chǎn)品及其制品中殘留。多菌靈在人體內(nèi)積累會導致慢性或急性中毒，其毒性作用可通過食道引起興奮、抽搐、精神恍惚、惡心嘔吐、頭昏頭疼、胸悶、上腹壓痛等中毒癥狀。ADI為0.03mg/kg·體重［3］。中國制定的多菌靈最低殘留限量為0.5mg/kg［4］，國際標準為最低殘留限量為0.1mg/kg［5］。目前測定水果蔬菜中多菌靈殘留量的方法主要有紫外可見分光法（GB/T 5009.188——2003）、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜法等［6－10］。氣相色譜需衍生，操作繁瑣；HPLC－MS雖然有較高的準確性和靈敏度，但使用儀器昂貴，操作復雜，不適合常規(guī)分析。而中國國家標準檢驗方法所使用的紫外分光光度法［11］，選擇性不高，易受樣品本底干擾，影響分析結(jié)果，并且在檢測過程中，需采用作圖法先求得校正吸光度，進而根據(jù)校正吸光度繪制待測物質(zhì)標準曲線，同時檢測水平較低。與上述方法相比較，本試驗所建立的檢測方法操作簡單，并且易于推廣應(yīng)用，同時可滿足甘藍中多菌靈殘留量的分析測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀：LC－20AD型，日本島津公司；

色譜柱（250mm×4.6mm i.d.，5μm）：Diamonsil C18，北京迪科馬公司；

微孔濾膜：0.45μm，華恒高科工程技術(shù)（北京）有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：LABOROTA 4000－efficient型，德國海道爾夫公司；

紫外光譜儀：UV－2450，日本島津公司；

超聲波清洗器：KQ－50B型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.2 試劑

多菌靈：純度98%，百靈威公司 （美國）；

甲醇：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

水：雙蒸水；

其它試劑（除非特別說明）：均為分析純。

1.2 標準溶液的配置

精確稱取0.1g多菌靈純品，用甲醇溶解定容至100mL，配制成濃度為1mg/mL的多菌靈標準溶液備用。

1.3 樣品的提取和凈化

1.3.1 樣品提取 準確稱取10g勻漿甘藍樣品于150mL錐形瓶中，用20mL乙腈溶液作為提取劑超聲提取20min后，抽濾；殘渣中再分2次加入10mL乙腈溶液，超聲提取10min后抽濾，合并濾液。向濾液中加入20mL 2%無水Na2SO4后，將提取液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用3×10mL的石油醚進行反萃取；水相再用3×10mL二氯甲烷萃取。將2次提取液合并用無水硫酸鈉干燥放置30min。脫水后將提取液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，室溫水浴濃縮近干。加入2mL乙腈重新溶解，待凈化。

1.3.2 弗洛里硅土固相萃取柱凈化 分別用2mL乙腈和2mL二氯甲烷預淋柱，加入試樣提取液，用15%乙腈－二氯甲烷混合液淋洗；收集洗脫液于蒸發(fā)瓶中，40℃水浴濃縮至近干；加入1.0mL甲醇重新溶解，過0.45μm濾膜，待分析。

1.4 液相色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，i.d.，5μm），流動相為V（甲醇）∶V（水）＝7∶3，流速0.3mL/min，柱溫30℃，進樣量10μL，檢測器為紫外檢測器，檢測波長286nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

蔬菜中多菌靈的提取溶劑主要有甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、丙酮（Acetone）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EA）等或者它們的混合溶劑［11－14］。洪月玲等［15］研究表明樣品中多菌靈經(jīng)丙酮、甲醇均可有效提取，但丙酮會有更多的共萃取雜質(zhì)，不僅增加色譜柱負荷而且提取液中的雜質(zhì)易干擾測定。不同提取劑對多菌靈提取率影響見圖1。

通過考察不同提取溶劑對多菌靈的提取效率發(fā)現(xiàn)，甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯及其混合溶劑對多菌靈的提取率低，提取率僅達到70%，不能滿足方法要求；而選用乙腈作為提取劑，則對多菌靈具有較高的提取率。綜合考慮，本試驗選用乙腈作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在保持流速條件不變的條件下，改變流動相的配比，分別使用體積比為6∶4，7∶3，8∶2，9∶1的甲醇－水進行檢測，考察不同體積比的流動相對多菌靈分離的影響。結(jié)果表明在分離實際樣品時，V（甲醇）∶V（水）＝7∶3時能在最短時間內(nèi)將多菌靈與甘藍中的基質(zhì)完全分離，且出峰效果較好，故本試驗選擇甲醇－水為流動相。在190～400nm波長范圍內(nèi)對多菌靈進行了紫外吸收掃，發(fā)現(xiàn)試樣在280～295nm處有較高響應(yīng)，因此本試驗選擇286nm作為檢測波長。多菌靈標準樣品以及甘藍試樣的色譜圖分別見圖2和圖3。

2.3 線性關(guān)系考察

取1mL多菌靈標準溶液（1mg/mL），用甲醇將其稀釋10倍作為工作液，再稀釋成濃度分別為50，10，5，1，0.1μg/mL系列標準溶液。按1.4的色譜條件進樣測定，進樣量10μL，測定峰面積。以標準溶液質(zhì)量濃度X（μg/L）為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標作標準曲線，見圖4。得線性回歸方程為：Y＝0.126 3X＋0.268 4，相關(guān)系數(shù)：r＝0.999 9；且標準曲線的相關(guān)性良好。結(jié)果表明，在0.05～10mg/mL范圍內(nèi)，多菌靈的質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度與重現(xiàn)性

取多菌靈標準溶液連續(xù)進樣9次，多菌靈峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.62%，表明方法的精密度良好。按照1.3的方法，取加標甘藍各9份，制備供試品溶液，依法進樣測定，計算含量。結(jié)果如表1所示，多菌靈含量的RSD為2.7%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.5 回收率試驗

分別稱取9份空白甘藍樣品（無多菌靈殘留）進行加樣回收試驗，對照品加入水平為0.20，0.40，0.60mg/kg，每個水平3個平行樣品，并按1.3的方法進行樣品的提取和凈化，通過外標法定量，得到相應(yīng)的平均回收率見表1。由表1可知，回收率符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

表1 多菌靈的回收率Table 1 Recoveries of carbendazim（n＝9）

3 結(jié)論

本試驗所建立的方法簡便、快速、靈敏、準確，適用性良好，對于甘藍中多菌靈的分離較好，多菌靈的回收率及重現(xiàn)性均符合農(nóng)藥殘留測定要求，可作為快速測定蔬菜中多菌靈殘留量的方法，同時可為其他農(nóng)產(chǎn)品及食品中多菌靈殘留的檢測。

1 劉乾開，朱念國.新編農(nóng)藥使用手冊［M］.第二版.上海：科學技術(shù)出版社，1999：309.

2 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所.2007農(nóng)藥管理信息匯編［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

3 吳旭剛，袁旭，龐宏宇.RP－HPLC法測定蔥、蒜類蔬菜中多菌靈的殘留［J］.食品科學，2008，29（8）：367～369.

4 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB2763——2005食品中農(nóng)藥的最大殘留限量［S］.北京：中國標準出版社，2006.

5 《主要貿(mào)易國家和地區(qū)食品中農(nóng)獸藥殘留限量標準》編委會.主要貿(mào)易國家和地區(qū)食品中農(nóng)獸藥殘留限量標準（食品卷）［S］.北京：中國標準化出版社，2006.

6 楊立武.分光光度法測定多菌靈殘留量的研究［J］.安徽化工，2006（4）：70～71.

7 Wang J T，Jiang Y P，Chen S C，et al.The different responses of glutathione－dependent detoxification pathwayto fungicide chlorothalonil and carbendazim in tomato leaves［J］.Chemosphere，2010，79（9）：958～965.

8 游俊，黃智輝，鄭俊超，等.固相萃?。咝б合嗌V法同時測定食用菌中多菌靈和噻菌靈殘留量［J］.理化檢驗－化學分冊，2009（45）：983～984.

9 Cao C F，Wang Z，Pommier J J，et al.Focused microwave assistance for extracting some pesticide residues from strawberries into water before their determination by SPME/HPLC/DAD［J］.Agric.Food Chem.，2001（49）：5 092～5 097.

10 中國國家標準化管理委員會.GB/T5009.188——2003蔬菜、水果中甲基托布津、多菌靈的測定［S］.北京：中國標準出版社，2003.

11 王登飛，陳練洪，游俊，等.固相萃?。璈PLC法同時測定果蔬中多菌靈和噻菌靈殘留量［J］.農(nóng)藥，2008，47（6）：443～444.

12 劉麗英，李桂榮，劉麗華.高效液相色譜法測定甘藍中多菌靈殘留分析方法農(nóng)藥科學與管理［J］.農(nóng)藥科學與管理，2006，25（7）：15～18.

13 趙領(lǐng)軍，岳暉，郭棟梁，等.UPLC－MS/MS法測定蘋果中苯并咪唑類農(nóng)藥殘留［J］.食品科學，2009，30（12）：209～212.

14 田宏哲，周艷明.高效液相色譜法對水果中多菌靈與福美雙殘留的同時測定［J］.分析測試學報，2010，29（1）：93～96.

15 洪月玲，鐘化艦，董小海.LC－MS/MS法測定水果、蔬菜中多茵靈殘留的研究［J］.河南預防醫(yī)學，2008（1）：19～21.

Determination of carbendazim residues in cabbage by HPLC

JI Shu－juan1YU Ji－cheng2GAO Xing1，2GUO Nai－fei1，2

（1.College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyan，Liaoning110161，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian，Liaoning116600，China）

The high performance liquid chromatography （HPLC）method for the simultaneous detection of carbendazim residues in cabbage was established.Residue was extracted from cabbage with ACN，cleaned up by Flory silica solid phase extraction（SPE），and separated on a C18column （250mm×4.6mm i.d.，5μm）using methanol－water formate（7∶3，by volume）as mobile phase at a flow rate of 0.3mL/min.The detection wavelength was set at 286nm.The results showed that the concentration of carbendazim and its peak area was linear，the minimum detection limit of 0.008mg/L，recovery was 84.8%～89.3.4%，relative standard deviation less than 2.7%.

HPLC；cabbage；carbendazim；residue

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.02.019

大連民族學院自主科研基金（編號：DC10030106）；大連民

族學院人才引進項目（編號：20086203）

紀淑娟（1960－），女，沈陽農(nóng)業(yè)大學教授。E－mail：jsjsyau＠sina.com

于基成

2010－12－14