膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測定何首烏中的二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚

吳 嫻，陳冠華，王 坤，石 杰，武傳芹

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測定何首烏中的二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚

吳 嫻，陳冠華，王 坤，石 杰，武傳芹

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法，建立測定何首烏中二苯乙烯苷、大黃素、大黃酚的新方法，對影響分離的諸因素進(jìn)行了優(yōu)化。緩沖液組成為25 mmol／L硼砂-40 mmol／L十二烷基硫酸鈉-10%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，p H值為9.5。在優(yōu)化的條件下，二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚可于20 min內(nèi)分離；線性范圍分別為10～1 000，5.2～260，4.5～225 mg／L；檢出限分別為1.10，0.29，0.43 mg／L；平均加標(biāo)回收率分別為98.8%，98.8%，100.7%。該方法可滿足何首烏中二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚的測定要求，可作為何首烏藥材的質(zhì)量控制方法。

膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜；何首烏；二苯乙烯苷；大黃酚；大黃素

何首烏為蓼科植物何首烏的干燥塊根，其根和莖所含蒽醌類、二苯乙烯苷類和磷脂類化合物是其藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。二苯乙烯苷（2，3，5，4＇-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）為何首烏主要的水溶性成分，具有抗衰老［1］、提高免疫力、防止動(dòng)脈硬化和保肝的藥理作用，其含量作為何首烏及其制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。蒽醌類成分是何首烏中公認(rèn)的主要活性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗菌消炎、利尿和抗腫瘤［2］、調(diào)節(jié)免疫功能［3］等作用。

目前文獻(xiàn)報(bào)道對二苯乙烯苷、大黃素、大黃酚的測定方法主要有紫外分光光度法、熒光法、薄層層析法、高效液相色譜法［4－8］。膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC）是毛細(xì)管電泳的一種分離模式，具有分離效率高、分析速度快、樣品用量和試劑消耗小等突出優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于蒽醌類［9－10］、皂苷類［11－14］、酚酸類［15－16］、黃酮類［17］、內(nèi)酯類［18］和生物堿類［19－20］等多種天然藥物成分的分離檢測。尚小玉等在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對大黃中大黃酚、大黃素、土大黃苷和大黃酸的分離［21］；張國慶等分離了何首烏中的7種蒽醌類成分，但僅能檢測出大黃素和大黃酸［22］；袁海龍等報(bào)道了以毛細(xì)管區(qū)帶電泳模式檢測何首烏中二苯乙烯苷的方法［23］。對何首烏中二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚進(jìn)行同時(shí)分離測定，可以為何首烏藥材質(zhì)量控制以及何首烏藥效成分提取工藝研究提供檢測方法，目前尚無采用MECC法對此3種成分進(jìn)行同時(shí)分離檢測的報(bào)道。筆者對此進(jìn)行了研究，與已報(bào)道的HPLC同時(shí)測定何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類的方法相比，本方法分析時(shí)間較短，3種成分可同時(shí)檢出。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CL1020高效毛細(xì)管電泳儀（北京彩陸科學(xué)儀器有限公司提供）；電源（電壓0～30 k V可調(diào)）；未涂層熔融石英毛細(xì)管柱（62 cm×75μm，有效長度為50 cm，產(chǎn)地為河北永年）；HW-2000色譜工作站（邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司提供）；高速中藥粉碎機(jī)（青州市精密制藥機(jī)械制造有限公司提供）；BS124S電子分析天平（賽多利斯公司提供）；p HS-2型酸度計(jì)（上海第二分析儀器廠提供）；B5500S-MT超聲清洗機(jī)（上海必能信超聲有限公司提供）；優(yōu)譜超純水機(jī)（成都超純科技有限公司提供）。

何首烏（鎮(zhèn)江市售）；二苯乙烯苷對照品（昆明科翔生物科技有限公司提供，純度＞98%）；大黃酚、大黃素對照品（上海博蘊(yùn)生物技術(shù)有限公司提供，純度＞98%）；硼砂、十二烷基硫酸鈉（SDS）、甲醇，均為分析純；水為二次重蒸水（電阻率為182 kΩ·cm）。

1.2 電泳條件

重力進(jìn)樣（16 cm×5 s），分離電壓為15 k V，檢測波長為254 nm，溫度為25℃。緩沖體系為25 mmol／L硼砂-40 mmol／L的SDS-10%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，p H 值為9.5。

第1次使用前，依次用1.0 mol／L的 HCl、水、0.1 mol／L的 NaOH、水和緩沖溶液沖洗毛細(xì)管5，3，10，3，10 min，在2次運(yùn)行之間依次用水、0.1 mol／L的 NaOH、水和緩沖溶液沖洗毛細(xì)管1，2，1，2 min。為了保證重現(xiàn)性，緩沖溶液每運(yùn)行3次后要進(jìn)行更新。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)和樣品溶液制備

精密稱定二苯乙烯苷、大黃素、大黃酚適量，分別以甲醇為溶劑，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（二苯乙烯苷質(zhì)量濃度為1 000 mg／L，大黃素質(zhì)量濃度為520 mg／L，大黃酚質(zhì)量濃度為450 mg／L），于4℃保存。在使用前，用甲醇稀釋為不同質(zhì)量濃度的工作溶液。

將一定量的何首烏粉碎過177μm（80目）篩。準(zhǔn)確稱取0.5 000 g，加入30 m L甲醇溶液，超聲提取60 min，冷卻至室溫，浸泡12 h后過濾。將濾渣用20 m L甲醇超聲提取60 min后過濾，合并2次濾液，減壓濃縮并定容至10 m L，用0.45μm濾膜過濾備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 硼砂緩沖液p H值的選擇

緩沖液p H值對組分的峰形和遷移時(shí)間均有影響。當(dāng)p H值低于8.5時(shí)，大黃素和大黃酚在60 min內(nèi)未見出峰；隨著p H值的升高，兩者均可出峰，但大黃酚峰形有拖尾現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是大黃素和大黃酚在較低p H值條件下發(fā)生沉淀析出并被吸附于管壁上所造成的。如圖1所示，隨著p H值的繼續(xù)上升，組分的峰寬逐漸變窄，拖尾現(xiàn)象得到改善。當(dāng)p H值在9.5以上時(shí)，大黃酚拖尾現(xiàn)象消失，但遷移時(shí)間會(huì)有所增加，綜合考慮遷移時(shí)間，選擇緩沖液的最佳p H值為9.5。

2.2 硼砂濃度的影響

緩沖液濃度在一定范圍內(nèi)可影響到電滲流、組分與管壁的相互作用和組分區(qū)帶的擴(kuò)散。圖2所示為硼砂濃度為10～30 mmol／L時(shí)對組分峰寬的影響。當(dāng)硼砂濃度較低時(shí)，大黃酚峰形拖尾嚴(yán)重；隨著緩沖液濃度的增加，大黃酚峰寬逐漸減小，同時(shí)電滲流降低，組分的遷移時(shí)間增長；當(dāng)硼砂濃度高于25 mmol／L時(shí)，基線噪聲較大，對檢出限有不利影響。綜合考慮峰形和基線噪聲的影響，選擇硼砂濃度為25 mmol／L。

圖2 硼砂濃度對分析物峰寬的影響Fig.2 Effect of buffer concentration on peak width

圖1 酸度對分析物峰寬的影響Fig.1 Effect of p H on peak width

2.3 SDS濃度的影響

圖3 SDS濃度對分析物遷移時(shí)間的影響Fig.3 Effect of SDS concentration on migration time

SDS濃度可影響組分的容量因子k′，從而對其遷移時(shí)間產(chǎn)生影響。SDS濃度對分析物遷移時(shí)間的影響見圖3。從圖3中可以看出，當(dāng)SDS濃度超過40 mmol／L時(shí)，組分的遷移時(shí)間隨SDS濃度的增大而增大，并且基線噪聲明顯增強(qiáng)；而當(dāng)SDS濃度小于40 mmol／L時(shí)，組分在管壁上存在吸附現(xiàn)象，峰形拖尾，且隨SDS濃度增大而逐步改善。這是由于緩沖液中的SDS可以通過疏水相互作用增強(qiáng)組分在膠束中的溶解，從而對其在管壁上的吸附產(chǎn)生一定抑制。綜合考慮遷移時(shí)間、檢出限和峰形，選擇SDS濃度為40 mmol／L。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

有機(jī)溶劑可以改善組分在緩沖液中的溶解度，從而使遷移時(shí)間變短，乙醇對分析物遷移時(shí)間的影響見圖4。從圖4可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于5%時(shí)，遷移時(shí)間隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而減?。坏?dāng)體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，遷移時(shí)間又會(huì)增大，這是乙醇體積分?jǐn)?shù)升高導(dǎo)致電滲流變小所致；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于10%時(shí)，大黃酚由于管壁吸附而峰形拖尾；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，大黃酚由于在緩沖液中溶解度增加而使其吸附得以抑制，拖尾逐步改善。綜合考慮遷移時(shí)間和峰形的影響，選擇乙醇的體積分?jǐn)?shù)為10%。

2.5 分離電壓的影響

研究了分離電壓為8～18 k V時(shí)對組分遷移時(shí)間的影響。結(jié)果表明，組分遷移時(shí)間隨分離電壓升高而下降，但電壓超過15 k V后將使基線噪聲增大，影響檢出限。綜合考慮遷移時(shí)間和基線噪聲的影響，選擇分離電壓為15 k V。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對分析物遷移時(shí)間的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on migration time

2.6 線性范圍和檢出限

按照優(yōu)化的電泳條件對不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列進(jìn)行測定，可得二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對空白樣品測定后按3倍信噪比獲得了組分的檢出限，結(jié)果如表1所示。

表1 檢出限、工作曲線及其線性范圍Tab.1 Detection limits calibration curves and linear dynamic ranges

2.7 方法的日內(nèi)和日間精密度

配制二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于配制當(dāng)日連續(xù)測定6次，可得日內(nèi)遷移時(shí)間和峰面積的RSD值；對同一標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制后6日內(nèi)每日進(jìn)行測定，可得日間遷移時(shí)間和峰面積的RSD值，見表2。

表2 精密實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Precision results

2.8 樣品測定結(jié)果和加標(biāo)回收率

按照樣品制備方法制備6份平行樣品，測得二苯乙烯苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為17.6 mg／g和3.8%；大黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.19 mg／g和3.37%；大黃酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.17 mg／g和2.97%。對照品和樣品的電泳圖如圖5所示。同時(shí)進(jìn)行3個(gè)質(zhì)量濃度級別的加標(biāo)回收率測定，結(jié)果如表3所示。

圖5 對照品和樣品的電泳譜圖Fig.5 Electropherograms of the reference substance and the extract

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery（n＝6）

3 結(jié) 語

樣品和加標(biāo)回收率測定結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確度和精密度較高，可滿足何首烏藥材質(zhì)量控制的要求。

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Determination of stilbene glycoside，emodin and chrysophanol in radix polygoni muliflori by micellar electrokinetic capillary chromatography

WU Xian，CHEN Guan-hua，WANG Kun，SHI Jie，WU Chuan-qin
（College of Food and Bioengineering，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

A new assay is developed by use of micellar electrokinetic capillary chromatography to determine stilbene glycoside，emodin and chrysophanol in radix polygoni muliflori.The factors affecting separation are optimized.The running buffer contains 25 mmol／L borax，40 mmol／L sodium dodecyl sulfate and 10%ethanol，and its p H value is adjusted to 9.5.Under the optimum conditions，the linear dynamic range is 2.0～1 000 mg／L for stilbene glycoside，5.2～260 mg／L for emodin and 4.5～225 mg／L for chrysophanol.The limits of detection are 1.10，0.29 and 0.43 mg／L for stilbene glycoside，emodin and chrysophanol，respectively.The average recoveries are 98.8%，98.8%and 100.7%for stilbene glycoside，emodin and chrysophanol.The assay meets the determination requirement of stilbene glycoside，emodin and chrysophanol in radix polygoni muliflori，and can be applied to quality control of the raw material of radix polygoni muliflori.

micellar electrokinetic capillary chromatography；radix polygoni muliflori；stilbene glycoside；chrysophanol；emodin

R284.1；O657.8

A

1008-1542（2011）05-0426-05

2011-05-23；

2011-09-10；責(zé)任編輯:張士瑩

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目 （20093227110010）；江蘇大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目 （08JDG001）；江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

吳 嫻（1986-），女，安徽馬鞍山人，碩士研究生，主要從事食品安全檢測方面的研究。

陳冠華教授。E-mail：chengh＠ujs.edu.cn