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    兩個99Tcm標(biāo)記胸苷衍生物在小鼠體內(nèi)分布的比較

    2011-12-25 03:00:20陸春雄蔣泉福張建康
    核化學(xué)與放射化學(xué) 2011年6期
    關(guān)鍵詞:荷瘤乙基巰基

    陸春雄,蔣泉福,唐 婕,譚 成,張建康

    1.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所 衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室/江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室,江蘇 無錫 214063;2.江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122

    目前,臨床常用的腫瘤顯像劑是氟(18F)標(biāo)記的2-脫氧-2-氟葡萄糖(18F-FDG),是葡萄糖的類似物。然而,18F-FDG不是腫瘤的特異顯像劑,因為還有很多其它細(xì)胞攝取葡萄糖比正常細(xì)胞高,如在炎癥灶處發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞[1]。另外,由于腦中的葡萄糖代謝很旺盛,所以18FFDG不適合腦部腫瘤的顯像。因此,研究者們不斷研發(fā)其它可供選擇的腫瘤顯像劑,如顯示腫瘤增殖的放射性標(biāo)記的胸苷衍生物:3’-脫氧-3’-氟胸苷[2](18F-FLT,結(jié)構(gòu)式如圖1所示)。但是,18F需要加速器生產(chǎn),而且18F標(biāo)記的分子探針需要在特殊防護(hù)的熱室中制備,這使得18F標(biāo)記的分子探針價格比較昂貴,廣大病人還難以承受。而锝(99Tcm)是SPECT顯像中使用最普遍的放射性核素,由鉬-锝發(fā)生器產(chǎn)生,價格低廉,而且有顯像需要的理想核素特性(半衰期6h,能量140keV)[3]。因此,很多研究小組[4-7]對胸苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種修飾,希望找到適合腫瘤顯像的锝標(biāo)記胸苷衍生物。

    本工作擬對胸苷嘧啶環(huán)的5位和N-3位進(jìn)行修飾,得到2個新的锝標(biāo)記胸苷衍生物的前體{2-巰基乙基-[2-(2-巰基乙基氨基)乙?;莅被?甲基-2’-脫氧尿苷(簡稱ANMdU)和N3-{N’-[(2-巰基乙基氨基)乙酰基]-2-氨基乙基巰基-1-己酰胺基}-胸苷(簡稱NHT)進(jìn)行標(biāo)記,得到99Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT(結(jié)構(gòu)式如圖1所示)。通過 考 察99Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT在 荷 瘤鼠體內(nèi)的生物分布,評價它們作為腫瘤顯像劑的可能性。

    1 實驗部分

    1.1 試劑和儀器

    β-胸苷,純度大于99%,新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司;對甲基苯甲酰氯和6-溴己酰氯,百靈威(J&K)化學(xué)試劑有限公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。鼠源性肝癌HepA腹水、ICR小鼠,均由江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所提供。

    MALDI SYNAPT Q-TOF MS質(zhì)譜儀,美國Waters公司;AVANCEⅢ400MHz核磁儀,瑞士Bruker公司;C5002γ-計數(shù)器,美國PACKARD-COBRA公司;Yanadimoto熔點(diǎn)儀,日本株式會社,溫度未校正。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 ANMdU的合成 ANMdU的合成及其鑒定等參見文獻(xiàn)[7]的報道。

    1.2.2 NHT的合成 合成路線圖示于圖2。

    (1)3’,5’-二(對甲基苯甲酰酯基)-胸苷(化合物1)的合成

    取8gβ-胸苷和1g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入到500mL三頸燒瓶中,加入250mL二氯甲烷,在攪拌條件下,滴加10mL對甲基苯甲酰氯,滴畢,加熱至回流,直至反應(yīng)溶液變澄清,將反應(yīng)液冷卻至室溫,用水洗滌,有機(jī)相干燥濃縮后,用二氯甲烷/乙酸乙酯(體積比為1∶1)重結(jié)晶,得13.8g白色晶體。產(chǎn)物產(chǎn)率為87.34%;熔點(diǎn)為202~204℃。

    圖1 18F-FLT、99 Tcm-ANMdU和99 Tcm-NHT的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of 18F-FLT,99 Tcm-ANMdU and 99 Tcm-NHT

    圖2 NHT的合成路線Fig.2 Scheme for synthesis of NHT

    (2)N-{[2-(2-(S-(4-甲氧基芐基)巰基)乙基氨基)乙?;?S-(4-甲氧基芐基)-2-氨基乙基巰基}-6-溴-1-己酰胺(化合物2)的合成

    在通氮?dú)鈼l件下,取2g N-[2-(2-(S-(4-甲氧基苯基)巰基)乙基氨基)乙?;?S-(4-甲氧基苯基)-2-氨基乙基硫醇和0.6g DMAP溶于50mL CH2Cl2中,于0℃滴加1g 6-溴己酰氯,滴畢,反應(yīng)液溫度逐漸升至室溫,繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h,分別加水和飽和NaHCO3溶液洗滌,有機(jī)層用無水Na2SO4干燥,濃縮過硅膠柱,洗脫劑為CH2Cl2,得2g白色固體。熔點(diǎn)為79~81℃。

    (3)N-{N’-[2-(2-(S-(4-甲氧基芐基)巰基)乙基氨基)乙酰基]-S-(4-甲氧基芐基)-2-氨基乙基巰基-1-己酰胺基}-3’,5’-二(對甲基苯甲酰酯基)-胸苷(化合物3)的合成

    在通氮?dú)鈼l件下,取0.2g化合物1,0.17g化合物2和2g K2CO3加入到100mL燒瓶中,加入50mL DMF/丙酮(體積比為1∶1)的混合液,于50℃攪拌反應(yīng)20h,將反應(yīng)液冷至室溫,過濾,將濾液蒸干后用100mL乙酸乙酯溶解,加水洗滌,有機(jī)層用無水Na2SO4干燥,濃縮過硅膠柱,洗脫劑為乙酸乙酯/石油醚(體積比為1∶1),得白色固體0.27g,產(chǎn)率為96.4%。

    (4)N-{N’-[2-(2-(S-(4-甲氧基芐基)巰基)乙基氨基)乙?;?S-(4-甲氧基芐基)-2-氨基乙基巰基-1-己酰胺基}-胸苷(化合物4)的合成

    取0.26g化合物3,加入30mL 0.27mol/L的甲醇鈉甲醇溶液,室溫攪拌反應(yīng)1h,蒸干甲醇,加50mL水和50mL氯仿振蕩,分出有機(jī)層,用無水Na2SO4干燥,濃縮過硅膠柱,洗脫劑為氯仿/甲醇(體積比為1∶1),得白色泡沫狀固體0.16g,產(chǎn)率為86.0%。

    (5)N-{N’-[(2-巰基乙基氨基)乙酰基]-2-氨基乙基巰基-1-己酰胺基}-胸苷(化合物5,NHT)的合成

    在冰水浴條件下,將0.15g化合物4溶于5mL三氟乙酸中,加入0.17g醋酸汞和0.26mL苯甲醚,反應(yīng)液呈棕色,將反應(yīng)液逐漸升至室溫,在室溫繼續(xù)攪拌30min,抽干溶劑,得深紫色油狀物,真空干燥30min,加入15mL干燥乙醚,攪拌10min,傾去乙醚,真空干燥30min,用15mL乙醇溶解干燥物,通硫化氫氣體20min后,4 000r/min離心5min取出上清液濃縮,得淡黃色油狀物0.09g,即標(biāo)記前體NHT,產(chǎn)率為68.7%。

    1.2.399Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT的制備 取30μg標(biāo)記前體(ANMdU或者NHT),溶于30μL乙醇中,加入80μL 10g/L葡庚糖酸鈉溶液、80μL 10g/L乙二胺四乙酸溶液、15μL 5g/L氯化亞錫溶液,再加入1mL(74MBq)高锝酸鈉淋洗液(Na99TcmO4),密閉,搖勻后于100℃加熱30min,冷卻后點(diǎn)樣,以聚酰胺薄膜為載體,甲苯/乙腈/甲醇(體積比為3∶1∶1)為展開劑。

    1.2.499Tcm-NHT的穩(wěn)定性研究 將制備得到的99Tcm-NHT通 過0.22μm的 無菌濾膜制成99Tcm-NHT注射液,分別于0、1、2、3、4、5、6h測定放射化學(xué)純度。

    1.2.5 肝癌HepA荷瘤鼠的制備 抽取保種小鼠體內(nèi)的肝癌HepA腹水,用生理鹽水稀釋4倍。取0.2mL腹水溶液(約2×106個腫瘤細(xì)胞)經(jīng)皮下注射,接種于小鼠的右前肢腋下,正常飼養(yǎng)一周左右,腫瘤直徑大約0.8cm,備下一步實驗。

    1.2.699Tcm-NHT正常小鼠體內(nèi)分布 取ICR小鼠25只,分為5組,每組5只,經(jīng)尾靜脈注射0.2mL(3.7×106Bq)99Tcm-NHT,分別于注射后5、30、60、120、180min斷頭處死。解剖取出腦、腫瘤、心、肝、脾和肺等臟器,稱重后測量放射性計數(shù),計算每克組織百分注射劑量率。

    1.2.799Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT在 肝 癌HepA荷瘤鼠體內(nèi)分布 取荷瘤鼠25只,分為5組,每組5只,經(jīng)尾靜脈注射0.2mL(3.7×106Bq)99Tcm-ANMdU(或99Tcm-NHT),分別于注射后5、30、60、120、180min斷頭處死。解剖取出腦、腫瘤、心、肝、脾和肺等臟器,稱重后測量放射性計數(shù),計算每克組織百分注射劑量率。

    2 結(jié)果和討論

    2.1 NHT的合成

    以β-胸苷為起始原料,經(jīng)多步反應(yīng)合成得到標(biāo)記前體NHT,反應(yīng)的總收率為34.68%。

    化合物1的MS(m/z):479(M+H),501(M+Na)。1H NMR(CDCl3,δ):8.22(s,1H),7.93(t,4H),7.29(t,4H),7.26(s,1H),6.43~6.48(q,1H),5.64(d,1H),4.64~4.81(dd,2H),4.52(q,1H),2.70(m,1H),2.43(d,6H),2.28~2.33(m,1H),1.62(s,3H)。

    化合物2的MS(m/z):611,613(M+H),633,635(M+Na)。1H NMR(CDCl3,δ):8.25(s,1H),7.25(m,4H),6.85(m,4H),4.01(s,1H),3.89(s,1H),3.76(s,6H),3.70(s,2H),3.68(m,2H),3.40~3.48(m,4H),3.30(s,2H),2.50~2.61(m,4H),2.28~2.38(m,2H),1.82(m,2H),1.60(m,2H,),1.45(m,2H)。

    化合物3的MS(m/z):1 009(M+H)。1H NMR(CDCl3,δ):8.23(s,1H),7.93(q,4H),7.22~7.23(m,8H),7.20(s,1H),6.83(m,4H),6.49(m,1H),5.62(d,1H),4.64~4.78(dd,2H),4.51(d,1H),3.89(s,2H),3.86(s,2H),3.78(s,6H),3.66(d,4H),3.32~3.42(m,4H),2.69(dd,2H),2.49~2.60(m,4H),2.42(d,6H),2.22~2.32(m,2H),1.64(s,3H),1.56(m,4H),1.33~1.37(m,2H)。

    化合物4的MS(m/z):773(M+1),795(M+Na)。1H NMR(CDCl3,δ):8.32(s,1H),7.33(s,1H),7.22(m,4H),6.83(m,4H),6.65(t,1H),6.16(m,1H),4.58(m,1H),3.98(dd,2H),3.93(m,2H),3.89(m,2H),3.78(s,6H),3.65~3.68(m,4H),3.32~3.42(m,4H),2.49~2.62(m,4H),2.42(m,2H),2.25~2.32(m,2H),2.22(m,1H),2.05(s,1H),1.91(s,3H),1.65(m,4H),1.35(m,2H)。

    化合物5的MS(m/z):533(M+1),555(M+Na)。1H NMR(CD3OD,δ):8.25(s,1H),7.82(m,1H),6.31(t,1H),4.37~4.42(m,1H),4.16(s,1H),3.97(dd,2H),3.92(m,2H),3.73~3.80(m,2H),3.61(m,2H),3.5(m,1H),3.33~3.43(m,4H),3.22(m,1H),2.59~2.73(m,4H),2.42~2.53(m,2H),2.16~2.33(m,2H),1.91(s,3H),1.58~1.74(m,4H),1.35~1.42(m,2H)。

    2.2 99Tc m-ANMdU和99Tc m-NHT的制備

    99Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT的 標(biāo)記率均大于95%,锝膠體的Rf值 為0~0.1,99Tcm-ANMdU的Rf值為0.6~0.7,99Tcm-NHT的Rf值為0.5~0.6。

    2.3 99Tc m-NHT的穩(wěn)定性

    結(jié)果表明,99Tcm-NHT 6h內(nèi)穩(wěn)定,放射化學(xué)純度仍然大于93%。

    2.4 99Tc m-ANMdU肝癌HepA荷瘤鼠體內(nèi)分布

    如表1所示,99Tcm-ANMdU在腎臟中的放射性攝取最高,膀胱次之,說明其主要是經(jīng)腎臟代謝,且99Tcm-ANMdU在體內(nèi)的清除很快,肝、腎、膀胱和血的5min時的放射性攝取與60min時放射性攝取的比值分別為4.22、3.13、4.21和12.06,這與99Tcm-ANMdU在 正常小鼠體內(nèi)分布相一致[7]。99Tcm-ANMdU注 射60min后,荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤的放射性攝取與肌肉、骨和血的放射性攝取的比值達(dá)到較高值,分別為1.58±0.17、1.95±0.31和1.17±0.08。

    表1 99 Tcm-ANMdU在荷瘤(HepA)小鼠體內(nèi)分布Table 1 Biodistribution of 99 Tcm-ANMdU in tumor-bearing(HepA)mice

    2.5 99 Tc m-NHT在正常小鼠和肝癌HepA荷瘤鼠體內(nèi)分布

    99Tcm-NHT在正常小鼠和肝癌HepA荷瘤鼠體內(nèi)分布結(jié)果列入表2、表3。由表2、3可知:99Tcm-NHT在正常小鼠和荷瘤鼠體內(nèi)肝臟和腎臟中的放射性攝取最高,說明其主要經(jīng)肝臟和腎臟代謝;99Tcm-NHT在體內(nèi)的清除相對較慢,在荷瘤鼠體內(nèi),肝、腎、膀胱和血的5min時的放射性攝取與60min時放射性攝取的比值分別為1.55、1.28、1.83和2.02,低 于99Tcm-ANMdU在體內(nèi)的清除速度(4.22、3.13、4.21和12.06),但與18F-FLT在小鼠體內(nèi)的清除速度接近[8]。值得注意的是,99Tcm-NHT在 脾 臟 中 的放射性攝取較高,且在60min時達(dá)到最大,這是因為脾臟中細(xì)胞增殖比較旺盛,與18F-FLT在脾臟中的放射性攝取增加相一致[8]。99Tcm-NHT注射120min后,荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤的放射性攝取與肌肉、骨和血的放射性攝取的比值達(dá)到較高值,分別為4.41±0.32、2.45±0.24和1.51±0.18,高于18F-FLT注射60min后腫瘤與肌肉、骨和血的放射性攝取比值[9]1.53、0.47、1.48。

    2.6 討論

    人們在不斷探索99Tcm標(biāo)記胸苷衍生物作為腫瘤顯像劑的潛力,較早的是2004年Zhang等[6]對2’-脫氧-2’-氟代尿苷的5位進(jìn)行修飾,通過戊烯基與N2S2配基連接,與99Tcm的標(biāo)記率為42%,放射化學(xué)純度為98%。2007年有多篇文獻(xiàn)報道有關(guān)99Tcm標(biāo)記胸苷衍生物的研究,如Teng等[4]對胸苷的3’位進(jìn)行修飾,通過肼基煙酰胺(HYNIC)和其他配基一起進(jìn)行99Tcm標(biāo)記,放射化學(xué)純度大于97%。這兩篇文獻(xiàn)都只報道合成和標(biāo)記方面,而沒有生物學(xué)的評價和顯像。Celen等[3]對胸苷的N-3位進(jìn)行修飾,通過丙基連接N2S2配基,認(rèn)為由于99Tcm標(biāo)記的基團(tuán)太大,導(dǎo)致99Tcm標(biāo)記胸苷衍生物對胸苷激酶(TK)的親和性降低,顯像結(jié)果不佳;然而,Desbouis等[5]研究發(fā)現(xiàn),5’位進(jìn)行修飾通過長鏈連接99Tcm的胸苷衍生物與TK有很好的親和性。這說明可能胸苷母體結(jié)構(gòu)與99Tcm標(biāo)記基團(tuán)之間的距離比99Tcm標(biāo)記基團(tuán)尺寸大小,對胸苷衍生物和TK親和性的影響更大。

    表2 99 Tcm-NHT在正常小鼠體內(nèi)分布Table 2 Biodistribution of 99 Tcm-NHT in normal mice

    表3 99 Tcm-NHT在荷瘤(HepA)小鼠體內(nèi)分布Table 3 Biodistribution of 99 Tcm-NHT in tumor-bearing(HepA)mice

    本工作的ANMdU是胸苷母體結(jié)構(gòu)在5位通過1個亞甲基與N2S2配基相連,胸苷母體結(jié)構(gòu)與99Tcm標(biāo)記基團(tuán)之間的距離很近;NHT是胸苷母體結(jié)構(gòu)在N-3位通過1個六碳鏈與N2S2配基相連,胸苷母體結(jié)構(gòu)與99Tcm標(biāo)記基團(tuán)之間的距離比ANMdU的大,而且99Tcm-NHT在腫瘤的放射性攝取與肌肉、骨和血的放射性的比值高于99Tcm-ANMdU相應(yīng)的比值。這說明隨著胸苷母體結(jié)構(gòu)與99Tcm標(biāo)記基團(tuán)之間距離的增大,可能可以增加胸苷衍生物對TK的親和性。

    3 結(jié) 論

    99Tcm-ANMdU在荷瘤鼠體內(nèi)主要經(jīng)腎臟代謝,且在體內(nèi)清除迅速,但在腫瘤和血的放射性比值不高;99Tcm-NHT在小鼠體內(nèi)清除比99Tcm-ANMdU緩慢,但120min時腫瘤中的放射性攝取較高,腫瘤和肌肉、骨及血的放射性比值分別為4.41±0.32、2.45±0.24和1.51±0.18,99Tcm-NHT可能是潛在的SPECT腫瘤顯像劑,值得進(jìn)一步研究。

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