一株產(chǎn)耐高溫淀粉酶菌株DW027的鑒定

陳 敏，王國強(qiáng)，余慧娟，朱苗青，章雅菁，汪 玨，向太和

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036）

一株產(chǎn)耐高溫淀粉酶菌株DW027的鑒定

陳 敏，王國強(qiáng)，余慧娟，朱苗青，章雅菁，汪 玨，向太和

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036）

結(jié)合表型性狀分析和16SrRNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行菌株的鑒定.結(jié)果顯示，DW027菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢.在LB平板培養(yǎng)基上，菌落呈白色、圓形.16SrRNA基因序列分析表明，與枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）標(biāo)準(zhǔn)序列的同源性達(dá)99%，初步鑒定為枯草芽孢桿菌.

淀粉酶；菌種鑒定；16SrRNA

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的統(tǒng)稱，是最早實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、迄今用途最廣產(chǎn)量最大的酶制劑品種之一［1］，廣泛應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等.它所具有的重要商業(yè)價值，致使人們積極尋找產(chǎn)生該酶的新菌株，或者用生物工程的方法尋找該酶的基因，改造菌株［2］.

耐高溫淀粉酶是淀粉加工中有重要用途的一種酶，因為以淀粉為原料的工業(yè)生產(chǎn)過程一般在高溫下進(jìn)行.在液化淀粉方面，耐高溫淀粉酶與一般細(xì)菌淀粉酶相比具有節(jié)約能源、降低成本等優(yōu)點，且耐高溫淀粉酶穩(wěn)定性好、保存條件范圍寬、易于儲存和運輸［3］.目前，國內(nèi)有關(guān)耐高溫淀粉酶的菌種篩選、淀粉酶的性質(zhì)等方面已有不少報道.張強(qiáng)等［4－5］從土壤中分離到一株能在55℃生長并分泌耐高溫α－淀粉酶的菌株，經(jīng)初步鑒定為芽孢桿菌.宋素琴等［6］從烏魯木齊地區(qū)的啤酒廠等地采集樣品，篩選到一株酶活較高的α－淀粉酶產(chǎn)生菌，經(jīng)生理生化反應(yīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究.王春銘等［7］從堆肥中篩選到一株能在55℃生長并分泌高溫α－淀粉酶的菌株，經(jīng)初步鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis），該菌株對污泥有機(jī)質(zhì)具較強(qiáng)降解能力.但總體來看，目前國內(nèi)淀粉酶生產(chǎn)菌株仍比較單一，淀粉酶酶活也較國外同行業(yè)低.該實驗室通過平板篩選的方法，從杭州七堡污水處理廠污泥樣品中分離到一株產(chǎn)耐高溫淀粉酶的菌株DW027（另文報道），通過表型性狀和16SrRNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析等方法進(jìn)行了菌株鑒定，為工業(yè)應(yīng)用開發(fā)新的淀粉酶資源打下基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 菌 株

DW027菌株：杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院微生物實驗室分離保存.

BacillussubtilusAB92068（標(biāo)準(zhǔn)菌株）：購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心.

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 2%，pH 7.0.

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂0.6%，pH 7.0.

1.3 主要試劑和儀器

UNIQ－10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（SK－1201）、蛋白酶K、溶菌酶、Taq DNA聚合酶等購自上海生工，其他化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純試劑.

主要儀器有光學(xué)顯微鏡（Nikon YS2）、掃描電子顯微鏡（JEOL model JSM5600LV）、全自動高壓滅菌鍋（NVE－50）、電子天平（BP2100S型）、高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5810R）、電泳儀（DYY5型）、PCR儀（DTC－100）等.

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)鑒定

將菌種在LB斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)14～16h，分別進(jìn)行單染色、革蘭氏染色和芽孢染色等形態(tài)觀察，方法參見《常見細(xì)菌鑒定手冊》［8］.

將菌種在LB平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24h，對菌落形態(tài)進(jìn)行描述.

1.4.2 生理生化鑒定

用標(biāo)準(zhǔn)菌株做對照，依據(jù)文獻(xiàn)相關(guān)內(nèi)容［8－9］進(jìn)行.

1.4.3 16SrRNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

基因DNA的提取、16SrRNA的擴(kuò)增及序列分析參見文獻(xiàn)［10］.引物采用細(xì)菌16SrRNA PCR擴(kuò)增通用引物BSF8P20（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和BSR1541P20（5′－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3′）.PCR擴(kuò)增條件：94℃下預(yù)變性10min，按照94℃45s、55℃45s、72℃90s進(jìn)行30個循環(huán)，最后在72℃延伸10min.將16SrRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工進(jìn)行序列測定.通過GenBank數(shù)據(jù)做相似性分析，然后通過MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 DW027菌株的形態(tài)鑒定

通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察，DW027菌體細(xì)胞呈桿狀，大小為2.8μm×0.75μm，革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢，中生，芽孢橢圓形，芽孢囊不明顯膨大（圖1）.

LB瓊脂平板上培養(yǎng)48h的菌落形態(tài)為圓形，扁平，邊緣不整齊，白色，不透明，菌落質(zhì)地濕潤，表面有褶皺（圖2）.

2.2 16SrRNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

16SrRNA序列常用于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析.利用細(xì)菌16SrRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，序列測定結(jié)果表明，16SrRNA擴(kuò)增片段長度為1 514bp，GenBank登錄號EU650320.

利用Blast軟件與數(shù)據(jù)庫中已有細(xì)菌16SrRNA序列進(jìn)行相似性比對分析，結(jié)果表明：菌株DW027與芽孢桿菌屬（Bacillus）相似性最高，與多個枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilus）菌株序列相似性高達(dá)99%.利用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖3所示.

圖3 依據(jù)16SrRNA基因序列比較構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain DW027based on analysis of 16SrRNA sequences

2.3 生理生化鑒定

DW027菌株的生理生化試驗結(jié)果如表1所示.除需氧性以外，其主要特征與標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus subtilusAB92068相吻合.綜合以上結(jié)果，初步鑒定DW027菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilus）.

表1 菌株DW027的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain DW027

3 結(jié) 論

該研究利用細(xì)菌16SrRNA一對通用引物，對DW027進(jìn)行16SrRNA序列同源性分析.擴(kuò)增結(jié)果與GeneBank上的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對后顯示，DW027菌株與枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)序列的同源性都在99%以上.生理生化鑒定結(jié)果進(jìn)一步表明其主要特征與枯草芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株吻合.因此，初步鑒定DW027菌株為枯草芽孢桿菌.

致謝：胡健饒老師在電鏡技術(shù)方面給予了悉心的指導(dǎo)，謹(jǐn)致謝意！

［1］胡欣潔，李凜，王忠彥，等.耐酸性α－淀粉酶產(chǎn)生菌的選育［J］.釀酒科技，2005（5）：39－41.

［2］Pandey A，Nigam P，Soccol C R，etal.Advances in microbial amylases［J］.Biotechnol Appl Biochem，2002，31：135－152.

［3］林必博.耐高溫α－淀粉酶的研究進(jìn)展［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，15（2）：77－80.

［4］張強(qiáng)，黃丹，王川.耐高溫α－淀粉酶產(chǎn)生菌的選育研究［J］.中國釀造，2008（7）：21－23.

［5］張強(qiáng)，劉成君，蔣芳，等.耐高溫α－淀粉酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及發(fā)酵條件和酶性質(zhì)研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（2）：34－37.

［6］宋素琴，茆軍，顧美英，等.一株堿性高溫α－淀粉酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)初步研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（9）：1803－1807.

［7］王春銘，雷恒毅，王國惠，等.高溫α－淀粉酶菌的產(chǎn)酶條件、酶性質(zhì)與環(huán)境應(yīng)用研究［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，27（4）：600－607.

［8］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：253－298.

［9］Hot G T，Krieg R N，Sneath H A P，etal.Bergey's manual of systematic bacteriology［M］.9th ed.Baltimore：Willians and Wilkins，2001：294－334.

［10］奧斯伯F，布倫特R.精編分子生物學(xué)實驗指南［M］.顏子穎，王海林，譯.北京：科學(xué)出版社，1998：1330－1361.

Identification of a Thermo－α－Amylase Producing Strain DW027

CHEN Min，WANG Guo－qiang，YU Hui－juan，ZHU Miao－qing，ZHANG Ya－jing，WANG Jue，XIANG Tai－h(huán)e
（College of Life and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

A thermo－α－amylase producing strain DW027was identified based on phenotypic characters and phylogenetic analysis as well as 16SrRNA gene sequencing.The results show that the strain is Gram－positive，endospore－forming，rods in shape.Colonies of strain DW027were white，convex and round on LB plates.The 16SrRNA gene sequencing analysis show that the strain is closely related to the member ofBacillussubtilis，with which they share 99%similarity.

amylase；identification；16SrRNA

Q93

A

1674－232X（2011）06－0481－04

10.3969/j.issn.1674－232X.2011.06.001

2011－06－28

浙江省自然科學(xué)基金項目（Y307452）；杭州市科技發(fā)展計劃項目（20101032B26）.

陳 敏（1963—），女，浙江杭州人，教授，主要從事微生物研究.E－mail：mchen63＠163.com