珠子參DNA的不同提取方法的研究

楊燊

摘要：目的：探討適合SSR標(biāo)記的DNA不同提取方法。方法：用經(jīng)典CATB法,改良CATB法， SDS法，高鹽低PH法，提取新鮮珠子參根部中總DNA，并對(duì)DNA進(jìn)行電泳得出最佳提取方法。結(jié)論：最佳提取方法為改良CATB法。

關(guān)鍵詞：珠子參； DNA提取；SSR分析； CATB法；SDS法；高鹽低PH法

Beads and DNA from different methods

YangShen

(Yuxi teachers college, Resources and environment college, Biological science)

Abstract: objective: to study the different extraction methods of the SSR markers for the DNA. Methods: using classical CATB method, advanced CATB method, SDS method, high salt low PH method, fresh and root extract beads of total DNA, and through electrophoresis obtains the best extraction method. Conclusion: the best extraction method for improvement CATB method.

Keywords: beads; DNA extracted; SSR analysis; CATB method; SDS method; High salt low PH method

珠子參(PanacisMajirisRhizama)屬于五加科、串珠狀根莖植物，別稱鈕子七、珠兒參、扣子七。分布于我國(guó)的四川、陜西、云南等省。具有活絡(luò)、止血的功效 [1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示, 珠子參具有較廣泛的藥理作用, 對(duì)心血管系統(tǒng)、血液及造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腫瘤等均有作用[2]。因此珠子參具有極高的研究?jī)r(jià)值，所以本實(shí)驗(yàn)用珠子參作為材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。珠子參根部次生代謝產(chǎn)物較多，其中酚類多糖類物質(zhì)會(huì)影響珠子參總DNA的提取及SRR分析。本實(shí)驗(yàn)主要為了選取適合SSR分析的DNA不同提取方法的最佳方法，以便更加有效地提取珠子參總DNA。

1材料與實(shí)驗(yàn)方法及操作

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料取自大理市鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠的珠子參。該實(shí)驗(yàn)需要用到不同的提取方法及不同的保存方法，所以將各類方法和保存方法做如下標(biāo)記：A、經(jīng)典CTAB法 ，B、改良CTAB，C、SDS法，D、高鹽低PH值法。

1.1.2儀器

離心機(jī)，水浴鍋，冰箱，電泳儀，移液槍，RCP擴(kuò)增儀，凝膠成像儀

1.1.3試劑

CTAB提取緩沖液：(10.00gCTAB，50.0mL 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，

20.0mL 0.5mol/L EDTA，41.00g NaCl，定容至500mL）；

3%SDS提取緩沖液：(0.1mol/L Tris-HCl（pH8.0），0.05mol/L EDTA-Na2

， SDS，定容至250mL)；

去多糖Buffer：(100ml Tris-HCl(1mol/L)，50ml EDTA(0.5mol/L），NaCl7.305g，定容至500ml)；

高鹽低PH值提取緩沖液：(0.1mol/L、pH=4.8 NaAc,0.05mol/L、pH8.0 EDTA-Na2，0.5mol/L NaCl，2%PVP，2%SDS，pH=5.5)；

TE：(5ml 1mol/L Tris-HCl，1ml 0.5mol EDTA, 定容至500ml)；

3%瓊脂糖凝膠：(0.6g瓊脂糖,20ml 1%TBE緩沖液)；

10X的TBE：（Tris堿108.00g，EDTA7.44g，硼酸55g,定容至1000ml）；

40%的聚丙烯酰胺凝膠：（雙丙烯酰胺2.00g，丙烯酰胺38.00g，定容至100ml）；

6%的聚丙烯酰胺凝膠：（10xTBE 12ml，40%聚丙烯酰胺凝膠18ml，90ml H2O）；

銀染所需試劑：（0.1%AgNO3溶液，3%Na2CO3溶液,10%HAc溶液,1%Na2S2O3溶液）；

0.5mol/L EDTA，β-巰基乙醇，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，Tris飽和酚，氯仿/異戊醇(V/V=24:1)，異丙醇，75%乙醇，瓊脂糖，無水乙醇，5mol/L KAc，1X的TBE，TEMED，APS，硝酸，二甲苯氰，溴酚藍(lán)

1.2實(shí)驗(yàn)方法及操作

1.2.1 經(jīng)典CATB法[3] (有改動(dòng))

(1)取3份新鮮珠子參每份0.5g分別放入3個(gè)研磨中加入1200μl 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液混勻；(2)迅速將1.5ml離心管置于65℃水浴中，保溫60min,每隔15min溫和顛倒混勻； (3)待冷至室溫后，取出1.5ml離心管，取上清液于另一離心管，每管加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)溶液，混勻后至溶液呈乳濁狀，10000r/min離心10min；(4)小心將上清液相轉(zhuǎn)移至另一個(gè)1.5ml離心管中，標(biāo)號(hào)A1，A2，A3，在上清液中加入600μl預(yù)冷-20℃的異丙醇，輕輕混勻，至有白色絮狀沉淀出現(xiàn)，-20℃靜置保存1小時(shí)。(5)離心管從冰箱取出后10000r/min離心10min棄上清液，沉淀DNA；(6)用400μl 75%的乙醇洗2次， 7000r/min離心3min棄上清液；(7)然后再用400μl 無水乙醇洗，7000r/min離心3min棄上清液，然后置于空氣中干燥；(8)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2改良CATB法[3-4] (有改動(dòng))

(1) 取3份新鮮珠子參每份0.5g分別放入3個(gè)研磨中加入少許石英砂和PVP，加入1.2ml的Buffer去多糖和24μlβ-巰基乙醇充分研磨成粉末，迅速將研磨好的珠子參粉末裝入1.5ml離心管中；(2)10000r/min離心10min 棄上清液；(3)向3個(gè)1.5ml離心管中加入600μl 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液同時(shí)加入24μlβ-巰基乙醇，用毛細(xì)玻璃管攪拌充分；(4)迅速將1.5ml離心管置于65℃水浴中保溫60min，每隔15min溫和顛倒混勻；(5)待冷至室溫后，取出1.5ml離心管，每管加入240μlKAc，放入冰箱-20℃60min；然后10000r/min離心10min (6)小心將上清液相轉(zhuǎn)移至一干凈的1.5ml離心管中，同時(shí)加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)溶液，放入垂直振蕩器中充分混勻10分鐘，然后10000r/min離心10min；(7)取上清液且分別標(biāo)號(hào)B1，B2，B3干凈的1.5ml離心管中，然后加入640μl -20冰浴的異丙醇，放入-20℃冰箱冷凍60min；(8)取出后在10000r/min離心10min沉淀DNA，棄上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min離心3min棄上清液；然后再用400μl無水乙醇清洗，洗后7000r/min離心3min，棄上清液，沉淀放置空氣中干燥過夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3SDS法[5-6] (有改動(dòng))

(1) 取3份新鮮珠子參每份0.5g分別放入3個(gè)研磨中加入1200μl SDS提取緩沖液，并加入240μlβ-巰基乙醇充分研磨成粉末，迅速將研磨好的珠子參粉末裝入1.5ml離心管中；(2)65℃水浴保溫60min，每15min輕搖一次；(3)待冷卻后加入230μl 5mol/L KAc,混合后冰浴60min；(5)取出后10000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管中，每管加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)溶液，然后放入垂直振蕩器中充分混勻10分鐘；(4)取出后10000r/min離心10min；(5) 取上清液于分別標(biāo)號(hào)C1，C2，C3干凈的1.5ml離心管中，每管加入600μl預(yù)冷的異丙醇溶液混勻，放入-20℃冰箱冷凍60min；(6)取出后在10000r/min離心10min沉淀DNA；(7)棄上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min離心3min棄上清液；(8)然后再用400μl無水乙醇清洗，洗后7000r/min離心3min，棄上清液，沉淀放置空氣中干燥過夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4高鹽低PH值法[7-8] （有改動(dòng)）

(1) 取3份新鮮珠子參每份0.5g分別放入3個(gè)研磨中分別加入1200μl 高鹽低PH值提取緩沖液，充分研磨成粉末，迅速將研磨好的珠子參粉末裝入1.5ml離心管中；(2)65℃水浴保溫60min，每15min輕搖一次； (3)取出后10000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管中，每管加入600μl KAc溶液，然后混勻，放入-20℃冰箱冷凍60min ；(4)取出后10000r/min離心10min；(5) 取上清液于分別標(biāo)號(hào)D1，D2，D3干凈的1.5ml離心管中，每管加入600μl預(yù)冷的異丙醇溶液混勻，放入-20℃冰箱冷凍60min；(6)取出后在10000r/min離心10min沉淀DNA；(7)棄上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min離心3min棄上清液；(8)然后再用400μl無水乙醇清洗，洗后7000r/min離心3min，棄上清液，沉淀放置空氣中干燥過夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增[9] （有改動(dòng)）

將4種提取方法所提取的總DNA于NYC TECHNIK INC生產(chǎn)的ATC201 PCR擴(kuò)增儀用SSR分析[10]進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體積25μl，引物：5-TAGTAGCGACGATCACCACG-3。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下（1μl Tap酶,1μl dNTP(10mM),5μl 10Xbuffer(Mg2+ 20mM),1μl primerF, 1μl primerR, 1μl DNA模板（約50ng）,15μl H2O）。PCR擴(kuò)增體系如下（94℃5min,(94℃45s,53℃1min,72℃1min30s進(jìn)行36次循環(huán))，72℃7min, 4℃保存）。

1.4瓊脂糖凝膠電泳

用3%的瓊脂糖凝膠對(duì)4種提取總DNA進(jìn)行電泳。然后用凝膠成像儀拍照。

1.5聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染[11-12]（有改動(dòng)）

先用6%的聚丙烯酰胺凝膠與促凝劑TEMED和APS混合制作膠版，然后用PCR擴(kuò)增出來的樣品與溴酚藍(lán)混合后進(jìn)行點(diǎn)樣，250V電泳150min。取出板后進(jìn)行銀染，過程如下（先用25%的酒精溶液漂洗3min，再水洗1min；1.6%硝酸溶液硝化至二甲苯氰褪色，即藍(lán)色條帶變綠；1L 0.1%的AgNO3染色30min，水洗3min；1L 3%Na2CO3+2ml甲醛+200μl 1%Na2S2O3顯色5-10min，直到顯色滿意為止；停顯后照相保存相片，收拾清洗。

2結(jié)果與分析

2.1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果及分析

圖14種提取方法總DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

從此圖1中可以明顯看到4種方法都能提取得到總DNA。但是A、C、D總體來看都有電泳拖尾（說明有DNA在電泳過程中分解），只有B的拖尾是最少的甚至無拖尾。

2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果及分析

圖24種提取方法PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺電泳圖

從圖2中可以看到4種方法都能滿足SSR技術(shù)的PCR擴(kuò)增。

2.4實(shí)驗(yàn)分析

通過對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析得到方法B：改良CTAB提取法為珠子參根部DNA提取的最佳方法。因此對(duì)不同保存方法的珠子參根部DNA的提取采用方法B：改良CTAB提取法。

3討論

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：4種提取方法都能提取出滿足SSR分析的要求，相比之下改良的CTAB法更好。因?yàn)楦牧糃TAB法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）使用了石英砂，石英砂能使植物研磨更充分使細(xì)胞核破裂利于DNA提??；（2）使用了PVP，在實(shí)驗(yàn)過程中，珠子參中的許多酶被激活，因此產(chǎn)生了許多次級(jí)代謝產(chǎn)物如酚類、醌類等。PVP是一種酚的絡(luò)合物，可以和酚類物質(zhì)結(jié)合，能減少酚類的氧化從而減少酚類的含量[4-13]；（3）使用了β-巰基乙醇，它是一種強(qiáng)還原劑，可以減少多酚類物質(zhì)及醌類物質(zhì)對(duì)DNA的破壞作用[4-13]；（4）使用了去多糖buffer，在珠子參內(nèi)含有大量的多糖類物質(zhì)，在進(jìn)行DNA提取的過程中會(huì)有大量的多糖類物質(zhì)與DNA一同被析出，從而使提取的DNA不夠純凈。去多糖buffer能有效的除去大量的多糖類物質(zhì)；（5）使用了醋酸鉀，KAc能使DNA聚合物能更充分的沉淀，提高產(chǎn)率。

參考文獻(xiàn)

[1] 宋小妹;劉越;蔡寶昌. 珠子參的化學(xué)成分[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,(01)

[2] 賀海波,石孟瓊,陳濤,盧訓(xùn)叢,覃寧玲,陳述威.珠子參水提物抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,(20)

[3] 陳隨清,王利麗,段亮亮,賈永. 山茱萸葉脫氧核糖核酸(DNA)提取方法的研究[J]. 河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2005,(02) .

[4] 王春麗, 梁宗鎖, 李殿榮, 王灝, 舒志明. 丹參DNA提取方法的優(yōu)化[J]. 藥物生物技術(shù), 2007,(01)

[5] 李玉花主編;現(xiàn)代分子生物學(xué)模塊實(shí)驗(yàn)指南[M]北京:高等教育出版社，2007.07

[6] 陳莉,魏莉,周童,李敏瑜,覃玉斌,吳耀生. 幾種中藥DNA提取方法的比較研究[J]. 廣西植物 , 2007, (01)

[7] 陸丹,牛楠,李玥瑩. 高粱基因組DNA提取方法的比較與優(yōu)化[J]. 生物技術(shù), 2010,(03)

[8] 張繼紅, 陶能國(guó), 張小云, 雷瑤, 孫永祥. 三種豆科植物總DNA提取方法的比較[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007,(02)

[9] 裴黎, ?；坻? 涂政, 彭建雄, 馬原, 從斌, 毛澤善, 于靜娟. 改良高鹽低pH方法提取陳舊大麻DNA初探[J]. 中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志, 2009,(03)

[10] 曾莉娟,鄭成木. SSR技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2001,(03) .

[11] 李西平, 錢新華, 姚英民, 劉志杰, 劉陽. DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染方法的選擇[J]. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, (09)

[12] 傅占江,劉寶文,劉體全,謝明,江源,劉曉達(dá),王全立. DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳三種銀染方法比較[J]. 臨床軍醫(yī)雜志, 2002, (04) .

[13] 閆光照, 鄭根昌, 王偉, 劉鵬. β-巰基乙醇與PVP在紅干椒DNA提取中的比較研究[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2009,(01)

注：文章內(nèi)所有公式及圖表請(qǐng)以PDF形式查看。