強極性化合物DMC及其雜質(zhì)的HILIC分離方法研究

韓冰冰， 王翠翠， 李新軍， 鄒新琢

（華東師范大學(xué) 化學(xué)系，上海 200062）

強極性化合物DMC及其雜質(zhì)的HILIC分離方法研究

韓冰冰， 王翠翠， 李新軍， 鄒新琢

（華東師范大學(xué) 化學(xué)系，上海 200062）

建立以親水作用色譜法對強極性化合物甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨（DMC）及其雜質(zhì)進行分離分析的方法.使用Sepax HP-Cyano和X-Bridge HILIC兩種不同的親水作用色譜柱，以乙腈和水為流動相進行梯度洗脫，高效快速地實現(xiàn)了DMC及其所含雜質(zhì)的分離分析.通過這兩種色譜柱，共可以分離出甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DM）、甲基丙烯酸（MAA）、三甲基羥乙基氯化銨（CC）和對羥基苯甲醚（MQ）4種雜質(zhì).該方法具有較好的實用價值，能有效地應(yīng)用于強極性化合物的分離和分析中.

親水作用色譜； 甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨； 強極性化合物； 分離

0 引 言

甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨（Methacryloyloxyethyl Trimethyl Ammonium Chlo-ride，DMC）是一種具有碳碳雙鍵和季銨基的雙官能團化合物.它可以作為單體通過均聚或與其它乙烯基單體共聚反應(yīng)來合成各種陽離子型功能聚合物，被廣泛應(yīng)用于污水處理、造紙和石油開采等領(lǐng)域［1］.

DMC的合成方法如圖1所示，一般是以甲基丙烯酸甲酯（MMA）為原料，通過和N，N-二甲基氨基乙醇（DMAE）的酯交換反應(yīng)得到甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DM），進一步經(jīng)季銨化反應(yīng)得到DMC.為防止聚合等副反應(yīng)的發(fā)生，通常會在反應(yīng)中加入少量的如對羥基苯甲醚（MQ）等阻聚劑.兩步反應(yīng)為連續(xù)過程，因此最終產(chǎn)物中往往會含有少量上述物質(zhì)及在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一些如甲基丙烯酸（MAA）、三甲基羥乙基氯化銨（CC）等其他雜質(zhì).這些雜質(zhì)對DMC在下步的聚合反應(yīng)中影響很大，因此DMC及其雜質(zhì)的分離分析方法對于DMC的合成、生產(chǎn)及質(zhì)量監(jiān)控等有重要意義.

圖1 DMC的合成Fig.1 Synthesis of DMC

液相色譜分析對易聚合的DMC來說是優(yōu)選的分析方法.但由于DMC及其所含的雜質(zhì)大都是強極性物質(zhì)，而且性質(zhì)極其相似.以C18為代表的反相液相色譜（Reversed Phase Liquid Chromatography，RPLC）分析是當(dāng)前分離分析中應(yīng)用最為廣泛和常規(guī)的色譜模式.RPLC能對弱極性和中等極性化合物進行高效分離分析，但對于如DMC這樣存在多種強極性物質(zhì)的分析對象卻難以得到滿意的結(jié)果［2］.因為強極性化合物分子中的極性基團易與流動相形成偶極矩作用，而與非極性的固定相則缺乏這種作用，導(dǎo)致樣品難以或不被固定相保留，通常在死時間流出而無法達到彼此間的有效分離［3］.

強極性有機小分子在天然產(chǎn)物、合成藥物和各種有機中間體中廣泛存在.由于其強極性部分在分子中所占的比例高，因此彼此間相似度高，分離難度很大.用親水作用色譜法（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography，HILIC）來分離強極性化合物是近年來色譜研究的熱點領(lǐng)域之一.HILIC是一種以極性固定相（如硅膠或修飾氨基、氰基和羥基等極性基團的硅膠柱等），極性有機溶劑或含水極性有機溶劑為流動相的色譜模式［4］.與傳統(tǒng)正相液相色譜（Normal Phase Liquid Chromatography，NPLC）相似，化合物的保留時間隨化合物極性的增強而增加，但其所用的溶劑又與RPLC相似，采用與水互溶的極性有機溶劑（通常為乙腈），這樣就可以解決正相色譜中水溶性物質(zhì)不溶于流動相的問題.HILIC作為一種非常適合于強極性化合物定性定量分析的液相色譜新技術(shù)，自1990年被Alpert［5］提出以來，就廣受重視，并在天然產(chǎn)物的分離分析、藥物分析和蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［6－8］.

本文嘗試采用HILIC方法，通過比較不同的色譜柱，選擇合適的流動相及其它相關(guān)色譜條件，輔以高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（HILIC-HRMS）等方法，展開對強極性化合物DMC及其雜質(zhì)的分離方法研究，提出了它的一種新的分離分析方法，也希望對類似的強極性有機小分子的分離提供參考.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

色譜儀 Waters高效液相色譜儀，包括Waters 2487 DualλAbsorbance Detector、Waters Binary HPLC Pump、Waters Breeze工作站.

色譜柱 美國Sepax公司賽分Sepax HP-Cyano（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱；美國 Waters公司X-Bridge HILIC（4.6 mm×150 mm，3.5μm）色譜柱.

質(zhì)譜儀 Agilent 1100 LC-MSD液質(zhì)聯(lián)用儀.選用 Waters公司ACQUITY UPLC（BEH HILIC）（2.1 mm×50 mm，1.7μm）超高效液相色譜柱，并與質(zhì)譜聯(lián)用.

試劑 水為超純水（艾科浦超純水系統(tǒng)），乙腈為色譜純，二丁胺、磷酸、乙酸銨和乙酸均為市售分析純試劑，流動相使用前用0.45μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲脫氣.MQ、MAA、DM和CC均為市售分析純試劑，DMC樣品（80%水溶液，某公司提供）.

1.2 色譜條件

1.2.1 使用Sepax HP-Cyano（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱 參考了文獻［9］的色譜分析條件，流動相A為超純水（0.01 mol／L二丁胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3），流動相B為乙腈，流速為1 mL／min，柱溫為室溫，進樣量為20.0μL，檢測波長為224 nm，梯度洗脫條件為如表1所示.

表1 Sepax HP-Cyano柱的梯度洗脫條件Tab.1 Gradient condition with Sepax HP-Cyano column

1.2.2 使用 X-Bridge HILIC（4.6 mm×150 mm，3.5μm）色譜柱 流動相 A為乙腈（取300 mL加入0.12 mL乙酸），流動相 B為乙腈（0.005 mol／L乙酸銨，取300 mL加入0.12 mL乙酸），流速為0.8 mL／min，柱溫為室溫，進樣量為20.0μL，檢測波長為224 nm，梯度洗脫條件如表2所示.

表2 X-Bridge柱的梯度洗脫條件Tab.2 Gradient condition with X-Bridge column

1.2.3 質(zhì)譜聯(lián)用的色譜條件 使用 ACQUITY UPLC（BEH HILIC）（2.1 mm×50 mm，1.7μm）超高效液相色譜柱，流動相A為乙腈，流動相B為含10 mmol／L乙酸銨的乙腈，流速為0.4 mL／min，柱溫為室溫，進樣量為5.0μL，檢測波長為224 nm，梯度洗脫條件如表3所示.

表3 ACQUITY UPLC（BEH HILIC）柱的梯度洗脫條件Tab.3 Gradient condition with ACQUITY UPLC（BEH HILIC）column

1.3 溶液的制備

用微量移液器準(zhǔn)確移取DMC樣品1 mL于100 mL容量瓶中，加入流動相A定量稀釋至刻度后搖勻，經(jīng)超聲脫氣處理后待用.液體樣品均用此法配置.

取MQ等各對照品適量，精密稱定，加入流動相A溶解并定量稀釋成1 mg／mL的溶液，經(jīng)超聲脫氣處理后待用.其他固體樣品均用此法配置.

2 結(jié)果與討論

首先，我們嘗試采用美國Sepax公司的賽分HP-Cyano（4.6 mm×250 mm，5μm）柱作為HILIC色譜柱.由于該柱的硅膠填料上鍵合了強極性的氰基柱，理論上它可以加強極性化合物與固定相的作用，提高極性化合物的保留時間，增強極性化合物的分離效果.

考慮到DMC及其大多數(shù)雜質(zhì)只有低波長的紫外吸收，選擇224 nm作為檢測波長，在相應(yīng)的色譜條件下對MDC樣品進行檢測，分離得到5個主要的色譜峰（見圖2）.用標(biāo)準(zhǔn)樣品的疊加法或根據(jù)與各標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖的比較，確定了其中4個峰的歸屬：2.72 min處為甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DM）峰；3.39 min處為DMC主峰；5.31 min處為甲基丙烯酸（MAA）峰；7.95 min處為阻聚劑對羥基苯甲醚（MQ）峰.

圖2 80%DMC樣品溶液的Sepax HP-Cyano柱檢測圖（檢測波長224 nm）Fig.2 Chromatogram of the 80%DMC sample solution with UV detection

采用Sepax HP-Cyano柱的HILIC分析方法，在80%DMC樣品中，除了DMC之外，還成功地分離檢測到3個微量的強極性雜質(zhì)：甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DM）、甲基丙烯酸（MAA）和對羥基苯甲醚（MQ）.7.49 min峰與上述在反應(yīng)中可能產(chǎn)生的各雜質(zhì)樣品無一重疊，無法歸屬.為了考察其它類型親水色譜柱的分離分析效果，本文又嘗試了另一種新型的親水色譜柱X-Bridge.

X-Bridge HILIC柱是Waters公司近年來推出的新產(chǎn)品，由于其在硅膠骨架上引進了部分亞乙基橋，即有機－無機雜化硅膠，亞乙基橋的存在使硅氧鍵不易被水解，從而使該色譜柱對高pH值的堿性物質(zhì)具有極好的耐受性和機械強度，提高了分析條件的穩(wěn)定性及柱子的使用壽命.X-Bridge HILIC柱可以為強極性化合物提供合適的保留，如強極性堿或含胺的極性有機物等，同時又和多種檢測器，尤其是質(zhì)譜（MS）有良好的兼容性.和RPLC-MS相比，HILIC-MS的靈敏度較高，對含大量組分的復(fù)雜樣品的分析能力可與RPLC-MS互補，適用于分析那些在RPLC柱上無法保留的強極性代謝物組分.

采用X-Bridge HILIC（4.6 mm×150 mm，3.5μm）柱，選擇224 nm作為檢測波長.按實驗部分所述的色譜條件對MDC樣品進行檢測，分離得到了5個主要的色譜峰（見圖3）.用標(biāo)準(zhǔn)樣品的疊加法或根據(jù)與各標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖的比較，我們分別確定了4個峰的歸屬：1.36 min處為甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DM）峰；2.51 min處為DMC主峰；4.09 min處為三甲基羥乙基氯化銨（CC）峰；8.17 min處為對羥基苯甲醚（MQ）峰.

圖3 80%DMC樣品溶液的X-Bridge HILIC柱檢測圖（檢測波長224 nm）Fig.3 Chromatogram of the 80%DMC sample solution with UV detection

在此基礎(chǔ)上，選用 Waters公司與X-Bridge HILIC柱同類型的 ACQUITY UPLC（BEH HILIC）（2.1 mm×50 mm，1.7μm）超高效液相色譜柱，并與高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用，對DMC樣品進行HILIC-HRMS的分離與分析，得到的色譜圖如圖4所示.

圖4 80%DMC樣品溶液的ACQUITY UPLC柱檢測圖（檢測波長224 nm）Fig.4 Chromatogram of the 80%DMC sample solution with UV detection

由圖4可知，分別在1.16，2.61，3.22，3.63和4.50 min處分離出5個峰，各分出的峰進行聯(lián)機高分辨質(zhì)譜檢測.1.16 min的質(zhì)譜圖如圖5所示，因為甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DM）的分子量計算值為157.110 3，其 ［DM＋H］＋分子量計算值為158.118 1，推測該化合物為DM；2.61 min的質(zhì)譜圖如圖6所示，因［DMC-Cl］＋分子量計算值為172.133 8，推測該物為DMC；3.22 min和3.63 min的質(zhì)譜圖如圖7所示，因［CC-Cl］＋分子量計算值為104.107 5，推測該物為CC；4.50 min的質(zhì)譜圖如圖8所示，因［MQ＋H］＋分子量計算值為125.060 3，推測該物為 MQ.

圖5 t＝1.16 min峰的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of 1.16 min

圖6 t＝2.61 min峰的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrum of 2.61 min

圖7 t＝3.22 min和t＝3.63 min的質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrum of 3.22 min and 3.63 min

圖8 t＝4.50 min峰的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectrum of 4.50 min

HILIC-HRMS的分析結(jié)果和用X-Bridge柱的HILIC的分析結(jié)果大體相符.也得到了較好的分離效果，高分辨質(zhì)譜檢測確認(rèn)了DM、DMC、CC及MQ4種成分.

3 結(jié) 論

DMC及其雜質(zhì)均為強極性化合物，用常規(guī)的反相液相色譜法分離分析，較難取得好的分離分析效果.而采用親水色譜柱Sepax HP-Cyano柱和X-Bridge HILIC柱對DMC及強極性其雜質(zhì)進行HILIC分析，都取得了較好的分離分析效果.除了DMC之外，都各自可分離檢測到3個微量的強極性雜質(zhì).同為親水色譜柱，Sepax HP-Cyano柱和X-Bridge HILIC柱由于柱子填充物結(jié)構(gòu)的不同，其分離效果也略有不同.Sepax HP-Cyano柱可有效地同時分離出甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DM）、甲基丙烯酸（MAA）和對羥基苯甲醚（MQ）3種微量的強極性雜質(zhì)；而X-Bridge HILIC柱則可分離出甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DM）、三甲基羥乙基氯化銨（CC）和對羥基苯甲醚（MQ）3種微量的強極性雜質(zhì).兩種不同的色譜柱的交替使用，可以對DMC及其可能所含的4種雜質(zhì)進行有效的分離分析.該方法具有較好的實用價值，也為強極性有機小分子化合物的親水作用色譜分離方法提供參考.

致謝：沃特世科技（上海）有限公司白旭先生協(xié)助進行色質(zhì)聯(lián)用分析.

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Research on separation method of highly polar compound DMC and impurities in it by HILIC

HAN Bing-bing， WANG Cui-cui， LI Xin-jun， ZOU Xin-zhuo

（Department of Chemistry，East China Normal University，Shanghai 200062，China）

HILIC method was established to separate and analyze highly polar compound methacryloyloxyethyl trimethyl ammonium chloride（DMC）and its impurities.Using two different chromatographic columns：HP-Cyano column and X-Bridge HILIC column，highly polar compound DMC and its impurities were all well separated by gradient elution using acetonitrile and water as mobile phase.With the two different chromatographic columns，four impurities in DMC were separated，such as dimethylaminoethyl methacrylate（DM），methacrylic acid（MAA），choline chloride（CC）and Hydroquinone monomethyl ether（MQ）.This method has higher practical value，which can be used effectively in separated highly polar compounds.

hydrophilic interaction liquid chromatography（HILIC）； methacryloyloxyethyl trimethyl ammonium chloride（DMC）； highly polar compounds； separation

O657.7＋2

A

10.3969／j.issn.1000-5641.2011.06.016

1000-5641（2011）06-0132-07

2010-12

韓冰冰，女，碩士研究生，研究方向為精細(xì)有機合成.

鄒新琢，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為精細(xì)有機合成.E-mail：xzzou＠chem.ecnu.edu.cn.