節(jié)球藻和柱胞藻毒素免疫分析的前處理方法研究

李 雙， 殷浩文

（1.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062；2.上海市檢測中心，上海 201203）

節(jié)球藻和柱胞藻毒素免疫分析的前處理方法研究

李 雙1， 殷浩文2

（1.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062；2.上海市檢測中心，上海 201203）

采用固相萃取前處理技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays，ELISAs）檢測技術(shù)，研究了水樣中節(jié)球藻和柱胞藻毒素的免疫前處理方法.由于兩種藻毒素極性差異較大，分別對水樣中節(jié)球藻和柱胞藻毒素采用不同的前處理方法，具體如下.①節(jié)球藻毒素：先后用10 mL甲醇和10 mL純水活化C18柱，以3～4 mL／min的速度上樣后用10 mL純水淋洗，再用12 mL甲醇洗脫節(jié)球藻毒素，氮?dú)獯蹈珊蠹兯ㄈ葜? mL待測.②柱胞藻毒素：先后用10 mL甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取柱，以2～3 mL／min的速度上樣后用10 mL甲醇淋洗，再用12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫柱胞藻毒素，氮?dú)獯蹈珊笥?.1%氨水定容至1 mL待測.結(jié)果表明，這兩種前處理方法對節(jié)球藻與柱胞藻毒素的ElISAs檢測能保證有較好的回收率，加標(biāo)回收率可分別達(dá)到99.4%和77%.

節(jié)球藻毒素； 柱胞藻毒素； ELISAs

0 引 言

自1878年George Francis報(bào)道第一起澳大利亞有毒藍(lán)藻水華事件以來［1］，全世界范圍內(nèi)由于加速的水體富營養(yǎng)化（eutrophication）現(xiàn)象而產(chǎn)生的淡水水華越來越多.有毒藻類形成的水華或赤潮越來越頻繁地出現(xiàn)在沿海及內(nèi)陸水域，歐洲、美洲、非洲、大洋洲、中東和亞洲等地區(qū)均出現(xiàn)過藍(lán)藻引發(fā)的水華［2］，其中有50%～75%的藍(lán)藻水華會(huì)產(chǎn)生藻毒素［3］，并以微囊藻、節(jié)球藻和柱胞藻藻毒素最為常見.它們主要通過飲水或食用被毒素污染的水產(chǎn)品等途徑進(jìn)入人體，進(jìn)而影響人類健康［4］.目前對微囊藻毒素的研究較為普遍，而同樣廣泛發(fā)生的節(jié)球藻和柱胞藻毒素由于技術(shù)的原因（微量、干擾嚴(yán)重及前處理復(fù)雜等）研究較少.節(jié)球藻毒素（Nodularins，NOD）是一種環(huán)狀的五肽肝毒素，主要作用于肝臟，能抑制絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酶1和2A的活性，具有強(qiáng)烈的促肝腫瘤的作用［5］，它不僅是腫瘤促進(jìn)劑，也是直接的致癌物質(zhì)［6］.柱胞藻毒素（Cylindrospermopsins，CYN）是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種生物堿類肝毒素，主要作用于肝臟和腎臟組織，能夠抑制蛋白質(zhì)的合成，以共價(jià)修飾改變DNA或RNA引起基因損傷.柱胞藻毒素及其代謝物能夠作用于細(xì)胞分裂過程中的紡錘體或著絲粒，導(dǎo)致整個(gè)染色體丟失［7］.目前對于節(jié)球藻和柱胞藻毒素的分析方法幾乎空白，而節(jié)球藻和柱胞藻毒素在實(shí)際飲用水中的污染問題卻日漸嚴(yán)重，因此急需一種靈敏、快速、準(zhǔn)確的方法對其進(jìn)行檢測和定量.

對于藻毒素的前處理研究主要運(yùn)用于高效液相色譜法等化學(xué)檢測中，免疫檢測的樣品都不經(jīng)過前處理，水樣過濾后直接進(jìn)行免疫檢測.由于水樣的復(fù)雜背景會(huì)影響免疫檢測的效果，同時(shí)考慮到免疫檢測的特殊性，應(yīng)用于化學(xué)檢測中的前處理程序也不能直接用于免疫檢測.因此，本文在綜合國內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用比較研究的方法，以SPE技術(shù)和ELISAs為手段，對節(jié)球藻和柱胞藻藻毒素的富集前處理做了重點(diǎn)研究.在雜質(zhì)淋洗和目標(biāo)化合物洗脫等關(guān)鍵過程優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立了這兩種藻毒素的前處理方法，以保證水體中痕量毒素檢測的快速性和準(zhǔn)確性.

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

C18反相固相萃取柱（Waters，美國）；碳黑固相萃取小柱（CNW，德國）；0.22μm水相濾膜（MILLI-PORE，美國）；酶標(biāo)儀（BioTek，美國）；超純水系統(tǒng) （Milli-Q，美國）；甲醇（SIGMA，美國）；甲酸、三氟乙酸（ACROS，美國）；節(jié)球藻毒素／柱胞藻毒素檢測試劑盒（Beacon美國）.

1.2 節(jié)球藻和柱孢藻毒素的檢測步驟

按照試劑盒說明書操作進(jìn)行.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

藻毒素的固相萃取前處理流程為：活化柱子→上樣→淋洗→洗脫→吹干定容→Elisa檢測.

本次實(shí)驗(yàn)對該流程中節(jié)球藻毒素的淋洗，柱胞藻毒素的柱子活化及洗脫給予了重點(diǎn)優(yōu)化，具體步驟如下.

1.3.1 節(jié)球藻毒素淋洗方式優(yōu)化

100 mL純水中加入1 mL1μg／L的NOD標(biāo)樣，混勻后通過預(yù)先經(jīng)10 mL純甲醇和10 mL純水活化的C18固相萃取柱，流速3～4 mL／min，然后分別用10 mL純水、10%甲醇和20%的甲醇淋洗，每組做3個(gè)平行加標(biāo)和1個(gè)空白對照，12 mL純甲醇洗脫，收集于底部有刻度的梨形燒瓶中，洗脫液在35℃下用氮吹儀吹干，氮吹過程中用少量純甲醇淋洗瓶壁，吹干后用純水定容至1 mL，并利用水相針式過濾器（0.22μm）過濾到樣品瓶中，根據(jù)1.2步驟檢測，對比純水、10%甲醇和20%甲醇三者的淋洗效果.

1.3.2 節(jié)球藻毒素湖水加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

取0.22μm水相濾膜過濾后的淀山湖水100 mL，加入1 mL1μg／L的NOD標(biāo)樣，混勻，上樣后用10 mL純水淋洗，其它步驟同1.3.1.做3個(gè)平行加標(biāo)和1個(gè)空白對照.

1.3.3 柱胞藻毒素固相萃取柱活化方式

碳黑固相萃取小柱的活化有兩種方式：A組用10 mL純甲醇和10 mL純水活化，B組用10 mL甲醇和10 mL0.1%甲酸水溶液活化，兩組分別做3個(gè)平行加標(biāo)和1個(gè)空白對照.100 mL純水中加入1 mL1μg／L的CYN標(biāo)樣混勻，然后以2～3 mL／min的速度通過活化的碳黑固相萃取柱，用12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫，收集于底部有刻度的梨形燒瓶中，洗脫液于35℃下用氮吹儀吹干，氮吹過程中用少量純甲醇淋洗瓶壁，吹干后用0.1%氨水定容至1 mL，并利用水相針式過濾器（0.22μm）過濾到樣品瓶中，根據(jù)1.2步驟檢測得出結(jié)果，對比兩種活化方式的效果.

1.3.4 柱胞藻毒素洗脫溶劑優(yōu)化

選擇10 mL純甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱，采用純水加標(biāo)的方式，選擇含1%甲酸的50%甲醇和含0.1%三氟乙酸的甲醇作為洗脫溶劑，其他步驟同1.3.3，對比兩種洗脫溶劑的效果，每組分別做3個(gè)平行加標(biāo)和1個(gè)空白對照.

1.3.5 柱胞藻毒素湖水加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

但是，在RTK技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用過程中，如果系統(tǒng)誤差得不到完全的消除，就會(huì)影響工程數(shù)據(jù)的真實(shí)性、客觀性和準(zhǔn)確性。參考站作為一個(gè)工作站，其校正數(shù)據(jù)的有效作用距離就是RTK技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的最大問題。同時(shí)，GPS技術(shù)在使用過程中，受到空間相關(guān)性的影響，其誤差也隨參考站與移動(dòng)站的實(shí)際距離的改變而發(fā)生非線性變化，進(jìn)而導(dǎo)致定位精度降低。因此，在實(shí)際應(yīng)用過程中，必須采取一定的措施降低測量過程中的系統(tǒng)性誤差。

取0.22μm水相濾膜過濾后的淀山湖水100 mL，加入1 mL2μg／L的CYN標(biāo)樣，混勻，用10 mL純甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱，用含0.1%三氟乙酸的甲醇為洗脫溶劑，其他步驟同1.3.3.做3個(gè)平行加標(biāo)和1個(gè)空白對照.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 節(jié)球藻毒素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 節(jié)球藻毒素淋洗方式優(yōu)化

純水、10%甲醇和20%甲醇三者的淋洗效果如表1.結(jié)果顯示，淋洗中隨著甲醇濃度的增加，回收率逐漸降低，即淋洗損失的毒素也越來越多，而純水淋洗則能夠保證回收率在80.6%.因此，節(jié)球藻毒素的淋洗中，本實(shí)驗(yàn)選擇純水作為淋洗溶劑，以減少在這一過程中毒素的損失，保證回收率.

表1 淋洗方式優(yōu)化Tab.1 Optimization of purge solvent

2.2 節(jié)球藻毒素湖水加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

淋洗方式的優(yōu)化結(jié)果顯示純水的淋洗效果較好，為了驗(yàn)證在實(shí)際水樣中整個(gè)固相萃取流程的效果，做了湖水加標(biāo)實(shí)驗(yàn).結(jié)果如表2所示.選擇純水淋洗、甲醇洗脫的整個(gè)固相萃取流程回收率為83%～106.7%，平均回收率為94.3%，表明該固相萃取流程能夠作為實(shí)際水體中節(jié)球藻毒素免疫檢測的前處理方法.?

表2 NOD湖水加標(biāo)結(jié)果Tab.2 Recoveries of NOD added in lake water

2.3 節(jié)球藻毒素優(yōu)化后方法

優(yōu)化后的節(jié)球藻毒素前處理方法如下：分別用10 mL甲醇和10 mL純水活化柱子，以流速3～4 mL／min上樣，然后用10 mL純水淋洗，12 mL甲醇洗脫，洗脫液于35℃下用氮?dú)獯蹈?，純水定容? mL，4℃保存待測.整個(gè)流程如下，其中重點(diǎn)優(yōu)化步驟為淋洗方式.

2.4 柱胞藻毒素固相萃取柱活化方式

純水活化與0.1%甲酸水活化的效果對比如表3.結(jié)果顯示，兩者都能保證實(shí)驗(yàn)的回收率，但是純水活化的效果更好，而且取材方便.因此柱胞藻毒素固相萃取柱的活化就選擇純水，即選擇10 mL純甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱.

表3 固相萃取柱活化方式Tab.3 Optimization of activation

2.5 柱胞藻毒素洗脫溶劑優(yōu)化

用含1%甲酸的50%甲醇和含0.1%三氟乙酸的甲醇作為洗脫溶劑，對比兩種溶劑的洗脫效果，結(jié)果如表4所示.兩者都能充分洗脫柱胞藻毒素，回收率分別是100.4%和118.7%，由于后者在氮吹過程中比前者速度快，因此，洗脫溶劑就選擇0.1%三氟乙酸的甲醇，既能較快完成氮吹過程，又能充分洗脫毒素，提高效率.

表4 洗脫溶劑優(yōu)化結(jié)果Tab.4 Optimisation of eluent

表5 CYN湖水加標(biāo)結(jié)果Tab.5 Recoveries of CYN added in lake water

2.7 柱胞藻毒素優(yōu)化后方法

柱胞藻毒素的前處理優(yōu)化方法中對柱子的活化方式和毒素的洗脫溶劑進(jìn)行了重點(diǎn)優(yōu)化優(yōu)，具體步驟為：10 mL甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱，以2～3 mL／min的速度上樣，然后用10 mL甲醇淋洗，用12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫毒素，洗脫液在35℃條件下氮?dú)獯蹈桑?.1%氨水定容至1 mL，4℃保存待測.整個(gè)流程為：活化柱子→上樣→10 mL甲醇淋洗→0.1%三氟乙酸甲醇洗脫→吹干0.1%氨水定容→Elisa檢測.

3 討 論

ELISAs是應(yīng)用最為廣泛的一種免疫檢測方法，其基本原理是把抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與酶的高效催化作用相結(jié)合.它在實(shí)際檢測中具有一系列的優(yōu)勢，如靈敏度高、檢測速度快等，自1990年ELISAs就開始用于藻毒素的檢測［8］.但在實(shí)際水樣的檢測中，由于毒素含量低，水樣背景復(fù)雜，干擾因素多，在分析前一般需要對樣品進(jìn)行預(yù)富集.目前用固相萃取柱（Solid Phase Extraction，SPE）對藻毒素水樣進(jìn)行富集的方法已有很多研究.

在節(jié)球藻毒素的固相萃取中，洗脫液一般用純甲醇［9－11］，也有少數(shù)采用含有0.1%三氟乙酸的甲醇［12］.在本實(shí)驗(yàn)的ELISAs檢測中，HRP標(biāo)記的毒素與樣品中的毒素競爭結(jié)合數(shù)量有限的抗體位點(diǎn).研究顯示［13］，極少量的三氟乙酸也能強(qiáng)烈抑辣根過氧化物酶（HRP）的活性，甲醇對HRP也有著明顯的抑制作用，從而造成假陽性結(jié)果.因此本文選取純甲醇作為洗脫溶劑，氮?dú)獯蹈珊蠹兯ㄈ?，避免了有機(jī)溶劑對ELISAs反應(yīng)中HRP活性的干擾.湖水加標(biāo)結(jié)果顯示，該方法回收率為83%～106.7%，平均為94.3%，能夠滿足環(huán)境樣品免疫檢測的前處理需要.

對于柱胞藻毒素的固相萃取前處理，由于它的極性很強(qiáng)，在各種固相萃取柱上的保留效果都不是很好，有關(guān)環(huán)境水樣中柱胞藻毒素的富集方法研究尚少.一般是將毒素從藻細(xì)胞或水樣中萃取出來后直接進(jìn)行HPLC-PDA或HPLC-MS／MS分析.Sachiko［14］利用陰離子交換原理在Oasis MAX柱上富集環(huán)境水樣中的柱胞藻毒素，Metcalf［15］用C18柱和碳黑小柱串聯(lián)富集水樣中的柱胞藻毒素，把C18柱接在碳黑小柱前以除去水樣中非極性或弱極性干擾物，得到了滿意的富集效果.目前，國內(nèi)關(guān)于柱胞藻毒素的富集分析方法很少.參考文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)所選柱子的不同，一般有兩種不同的富集方法：甲醇—純水作活化液，1%甲酸的50%甲醇作洗脫液［16］，或者是甲醇—含0.1%甲酸的純水作活化液，0.1%三氟乙酸的甲醇作洗脫液［17］.本實(shí)驗(yàn)通過純水加標(biāo)的方式對這兩種活化方式和洗脫溶劑進(jìn)行了優(yōu)化.如前文所述，ELISAs檢測中HRP標(biāo)記的柱胞藻毒素與水樣中的毒素競爭結(jié)合有限的抗體，而HRP活性很容易被酸抑制，因此需要考慮氮?dú)獯蹈珊笙疵撘褐袣埩舻乃釋RP的影響.故在洗脫液吹干定容時(shí)用0.1%氨水定容，以避免殘留液中的酸抑制HRP活性造成假陽性的結(jié)果.湖水加標(biāo)結(jié)果顯示，該方法回收率為76%～78%，平均為77%，能夠滿足環(huán)境樣品免疫檢測的前處理需要.

4 結(jié) 論

WTO及我國的飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，水體中微囊藻毒素-LR含量不能高于1μg／L.對于節(jié)球藻和柱孢藻毒素，由于發(fā)現(xiàn)較晚且研究資料有限，目前還沒有國家和組織對其進(jìn)行含量限制.因此，本文的前處理方法可為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)依據(jù).

本文的節(jié)球藻和柱胞藻毒素的免疫前處理過程如下：①節(jié)球藻毒素 分別用10 mL甲醇和10 mL純水活化柱子，3～4 mL／min的速度上樣后10 mL純水淋洗，12 mL甲醇洗脫，洗脫液在35℃條件下氮?dú)獯蹈珊笥眉兯ㄈ葜? mL，4℃保存待測.②柱胞藻毒素 分別用10 mL甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱，2～3 mL／min的速度上樣后10 mL甲醇淋洗，12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫，洗脫液在35℃條件下氮吹儀吹干后用0.1%氨水定容至1 mL，4℃保存待測.這兩種前處理方法對節(jié)球藻和柱胞藻毒素的ELISAs檢測能保證有較好的回收率，加標(biāo)回收率可達(dá)到94.3%和77%，能夠滿足環(huán)境樣品免疫檢測的前處理需要，可用于環(huán)境水樣的監(jiān)測，確保廣大居民的飲用水安全.同時(shí)本方法的研究結(jié)果也能為建立節(jié)球藻和柱胞藻毒素的ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù).

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Ex-treatment of immunoassay method for nodularin and cylindrospermopsins

LI Shuang1， YIN Hao-wen2

（1.School of Life Science，East China Normal University，Shanghai 200062，China；2.The Bioassay and Safety Assessment，Shanghai Academy of Public Measurement，Shanghai 201203，China）

Effective solid phase extraction （SPE）ex-treatment method and sensitive enzymelinked immunosorbent asssay（ELISA）were developed for determining the nodularins（NOD）and cylindrospermopsins（CYN）in water samples.Due to the different polarities，two different ex-treatment methods were applied to NOD and CYN，respectively.The methods were developed as followed：①For NOD，firstly the C18column was activated by 10 mL methanol and 10 mL Milli-Q water；then the sample was applied to the column at 3-4 mL／min；after washing the column with10 mL water，the NOD was eluted with10 mL methanol；then the eluent was driedup with a rotary evaporator，and lastly the final volume was fixed to 1 mL with Milli-Q water for ELISA analyse.②For CYN，the carb SPE tubes were activated with10mL methanol and 10mL Milli-Q water；then the sample was applied to the tubes at 2-3 mL／min；after washing the tubes with 10mL methanol，the CYN was eluted with12 mL methanol containing 0.1%trifluoroacetic acid；then the eluent was dried up with a rotary evaporator，lastly the final volume was fixed to 1 mL with Milli-Q water containing 0.1%ammonia for ELISA analyse.The results indicated that these methods can guarantee the good recoveries of NOD and CYN for ELISA analyse，which could reach to 94.3%and 77%，respectively.

nodularins； cylindrospermopsins； ELISAs

Q89

A

10.3969／j.issn.1000-5641.2011.06.013

1000-5641（2011）06-0108-07

2010-11

上海市自然科學(xué)基金（08ZR1416600）

李雙，女，碩士研究生.E-mail：lis2011＠126.com.

殷浩文，男，教授級(jí)高級(jí)工程師，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué).E-mail：yinhaowen＠126.com.