高產(chǎn)胞外多糖紅曲菌株的篩選及形態(tài)學(xué)鑒定＊

汪鵬榮, 劉偉芬, 蔣冬花, 周 琴, 嵇 豪

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的由 10個分子以上單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物,是一類可以控制細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和衰老的活性多糖,是當(dāng)今醫(yī)藥和食品工業(yè)界共同關(guān)注的焦點(diǎn)[1].糖生物學(xué)已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的新前沿,糖鏈也被稱為生命科學(xué)中的第 3條鏈[2].紅曲菌 (M onascus)是一屬小型絲狀腐生真菌,屬子囊菌亞門 (Ascomycotina)不整囊菌綱 (Plectomycetes)散囊菌目 (Eurotiales)紅曲科 (Monascaceae)[3],是一種常用的藥用真菌.我國是世界上紅曲菌生產(chǎn)和應(yīng)用最早的國家,其中福建古田的紅曲最為有名,浙江、臺灣、兩廣等地區(qū)也有生產(chǎn),特別是浙江省近幾年來在紅曲的生產(chǎn)和應(yīng)用上有很大的發(fā)展.當(dāng)今國內(nèi)外對紅曲菌的研究很多,主要集中在莫納卡林 K(Monacolin K)、γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)和紅曲色素上,但對紅曲菌的另一功能性成分——紅曲多糖的研究卻很少.

目前,國內(nèi)外對靈芝多糖、香菇多糖、蟲草多糖等進(jìn)行了廣泛而深入的研究,雖然已有報道表明紅曲多糖同靈芝多糖、香菇多糖、蟲草多糖具有相似的生物學(xué)功能,但國內(nèi)對紅曲多糖的發(fā)酵生產(chǎn)工藝的研究較少,尚處于探索階段,而國內(nèi)相關(guān)研究報道的初篩紅曲菌株產(chǎn)胞外多糖的產(chǎn)量均處于較低的水平.本研究希望從浙江省不同地區(qū)分布的紅曲米中篩選出高產(chǎn)多糖的紅曲菌株.

紅曲菌屬種傳統(tǒng)的鑒定是以培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)為主要依據(jù)的[4],分類標(biāo)準(zhǔn)的研究有很多.本實(shí)驗(yàn)從浙江省各地采集到的紅曲米中分離純化得到 111株紅曲菌,通過搖瓶發(fā)酵篩選出 6株多糖產(chǎn)量相對較高且遺傳穩(wěn)定性好的紅曲菌菌種,并對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定,以其對后續(xù)研究奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 菌種及來源

111株紅曲菌的純培養(yǎng),分離自浙江省各地(溫州、義烏、東陽、金華、杭州等)收集到的紅曲米.

1.2 培養(yǎng)基

1)PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,瓊脂粉 18 g,水 1 000 mL,pH自然.

2)查氏合成培養(yǎng)基 葡萄糖 30 g,NaNO33 g,酵母提取物 1 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂粉18 g,水1 000 mL,pH 6.00.

3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖 40 g/L,酵母粉4.5 g/L,KH2PO4·3H2O 3.5 g/L,MgSO40.4 g/L,發(fā)酵液起始 pH 5.0[5].

4)CYA培養(yǎng)基 蔗糖 30 g,NaNO33 g,酵母提取物 5 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂 18 g,水 1 000 mL,pH 6.0[6].

5)G25N培養(yǎng)基 NaNO33.0 g,酵母提取物5.0 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂 15 g,補(bǔ)水至1 000 mL,待瓊脂溶化后加入 25%甘油,pH 6.0[6].

6)MEA培養(yǎng)基 麥芽浸出粉 20 g,蛋白胨1 g,葡萄糖 2 g,瓊脂 15 g,補(bǔ)水至 1 000 mL,pH 6.0[6].

1.3 紅曲菌的分離純化

分別取各地采集的紅曲米 0.5 g,用研缽研磨成粉狀,取少量均勻地灑入 PDA培養(yǎng)基表面,30℃培養(yǎng) 48 h左右,待白色絨毛狀菌絲長出后挑取少許菌絲轉(zhuǎn)接于另一 PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng) 1周后重復(fù)上述分離純化操作,經(jīng) 3次純化后即可得到紅曲菌的純培養(yǎng),將所獲各菌株編號,置 4℃冰箱中保存,備用.

1.4 紅曲多糖的提取

1.4.1 工藝流程[7]

菌種→斜面培養(yǎng)→搖瓶培養(yǎng)→離心除雜→上清液→減壓濃縮→醇沉→離心→沉淀→鼓風(fēng)干燥→紅曲粗多糖.

1.4.2 種子液的制備

用打孔器 (直徑 0.8 cm)分別取 30℃培養(yǎng)5 d的平板菌種 (5塊)接種到查氏合成培養(yǎng)基(250 mL三角瓶裝入 50 mL查氏液體培養(yǎng)基)中,在 30℃,轉(zhuǎn)速為 200 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)48 h.

1.4.3 紅曲菌的發(fā)酵培養(yǎng)

將上述種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為 8%,250 mL三角瓶中裝 100 mL培養(yǎng)液,在 180 r/min,30℃下培養(yǎng) 96 h.

1.4.4 紅曲粗多糖的測定

采用質(zhì)量法[8].將發(fā)酵濾液定容至 100 mL,取 15 mL加入 60 mL無水乙醇中,在 5℃下靜置8 h,過濾,在 80℃烘干 12 h至恒重,稱量.

1.4.5 生物量的測定[8]

紅曲菌經(jīng)搖床培養(yǎng)后,用 8層紗布過濾,得到的菌體在 80℃下烘干 12 h至恒重,稱量.

1.5 不同菌株菌絲生長速度的比較

采用 PDA斜面培養(yǎng)基,每個菌株接 3個平板,30℃恒溫培養(yǎng),5 d后測量各菌株的菌落直徑,取平均值作為不同菌株的菌絲生長速度.

1.6 高產(chǎn)多糖紅曲菌株生理生化特征的檢測

1.6.1 生長溫度

將紅曲菌株分別用打孔器接種到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度分別為 20,25,30,35和40℃,培養(yǎng) 5 d后觀察菌落直徑大小.

1.6.2 生長 pH條件

配制 pH分別為 3,4,5,6,7,8的查氏固體培養(yǎng)基.將紅曲菌株分別用打孔器接種到查氏固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 5 d后觀察菌落直徑大小.

1.6.3 碳源

以不含糖的查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,供試糖分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、番薯粉、可溶性淀粉、甘油,各種糖的加量均為 3%,配制好培養(yǎng)基后滅菌接種,30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d后觀察結(jié)果.

1.6.4 氮源

以不含NaNO3的查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,供試氮源為 (NH4)2SO4,NaNO3,蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入不同氮源,加量為 0.3%,配制好培養(yǎng)基后滅菌接種,30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d后觀察結(jié)果.

1.7 紅曲菌屬種鑒定

將搖瓶發(fā)酵篩選出的 6株高產(chǎn)胞外多糖紅曲菌菌種分別接種在上述MEA,CYA和 G25N培養(yǎng)基中,在 25℃培養(yǎng) 7,14和 25 d后觀察記錄菌落生長特征 (如:大小、顏色、表面結(jié)構(gòu)、氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、邊緣特征、生長與否、培養(yǎng)基內(nèi)可溶性色素等).根據(jù)文獻(xiàn) [4]中紅曲菌分種檢索表,并參考葉硯等[9]和郭紅珍等[10]的描述,對篩選的 6株高產(chǎn)多糖菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲菌種的分離純化

經(jīng)分離純化,獲得 111株紅曲菌.大部分紅曲菌菌落大而疏松,表層有氣生菌絲,呈絨墊狀,少數(shù)為皮膜狀;菌落大多色澤橙紅,少數(shù)為白色;菌落邊緣為白色,或淡黃色,背面顏色為深紅色.

2.2 產(chǎn)多糖紅曲菌的初篩

按上述多糖提取方法,對 111株紅曲菌進(jìn)行產(chǎn)多糖的初篩,結(jié)果見圖 1.由圖 1可知,大多數(shù)紅曲菌胞外多糖產(chǎn)量都較低,多為 1.0～3.0 g/L(占 72.7%).其中多糖產(chǎn)量在 5.0 g/L以上的只有 6株,分別為編號 MP-25,MP-45,MP-66,MP-70,MP-85和MP-99的菌株.

圖 1 111株紅曲菌胞外粗多糖產(chǎn)量的分布圖

2.3 高產(chǎn)胞外多糖紅曲菌株的復(fù)篩

對初篩出的 6株高產(chǎn)胞外多糖的紅曲菌株進(jìn)行了 3次重復(fù)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),結(jié)果 (見表 1)表明:僅菌株MP-66胞外多糖產(chǎn)量最高為 5.28 g/L;而且在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌株MP-66的多糖產(chǎn)量穩(wěn)定在 5.00 g/L以上,而其他 5株初篩高產(chǎn)多糖菌株的胞外多糖產(chǎn)量不是很穩(wěn)定,有較大幅度波動.因此,選定菌株MP-66為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的目的菌株.

表 1 6株高產(chǎn)胞外多糖紅曲菌株的平均多糖產(chǎn)量

2.4 菌絲生長速度和生物量的比較

對 6株初篩高產(chǎn)胞外多糖的紅曲菌株在平板培養(yǎng)基上的菌絲生長速度和在發(fā)酵液中菌絲體生物量的比較結(jié)果 (見表 2)表明:不同菌株在平板和液體培養(yǎng)基中的生長性能存在明顯的差異,有 3個菌株 (MP-25,MP-66和MP-85)在平板培養(yǎng)基上的生長速率較其他菌株快;而在發(fā)酵液的生物量方面,菌株MP-45最高達(dá) 14.04 g/L,其次為菌株MP-66和MP-25.因此,從菌株的生長速度和生物量方面考慮,并結(jié)合其胞外多糖的產(chǎn)量,選取高產(chǎn)胞外多糖的紅曲菌株MP-66用于今后進(jìn)一步的研究.

表 2 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株平板培養(yǎng)基上生長速度和液體發(fā)酵菌絲體生物量的比較

2.5 高產(chǎn)多糖紅曲菌株生理生化特征的比較

2.5.1 菌株生長溫度

從表 3可以看出:6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株在20～40℃均能生長;在 30～35℃生長最快;在20℃下生長緩慢;大多數(shù)菌株在 40℃下生長很緩慢,而 MP-66和 MP-70在 40℃仍能較好地生長.由此可見,MP-66和MP-70可能屬于耐高溫型紅曲菌.

2.5.2 菌株生長 pH

從表 4可知,6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株在 pH 3～8均能生長,其最適生長 pH為 5～6.因此,紅曲菌一般在弱酸性環(huán)境下培養(yǎng)最好.

2.5.3 菌株碳源利用

由表 5可知:6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株均能較好地利用蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和番薯粉,其中 5株紅曲菌能很好地利用乳糖和番薯粉,只有MP-85的最適碳源為麥芽糖;而對于葡萄糖,這 6株紅曲菌都未能達(dá)到最佳生長狀態(tài),原因可能是葡萄糖在滅菌過程中發(fā)生了焦糖化作用.MP-25和MP-70能在甘油中生長,其他 4個菌株在甘油中不能生長或者生長得不好.因此,紅曲菌株對甘油的利用情況在紅曲菌的分類鑒定上有一定的參考價值.

表 3 不同溫度下 6株高產(chǎn)多糖菌株的生長情況

表 4 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株在不同 pH條件下的生長情況

表 5 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株的碳源利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.4 菌株氮源利用

由表 6可知,6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株對氮源的利用差別不大,均能利用表 6中的 5種氮源,但它們在有機(jī)氮源中明顯較無機(jī)氮源中生長更好.

2.6 高產(chǎn)多糖菌株菌落特征和顯微特征的比較

6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株在 CYA,MEA和G25N培養(yǎng)基上 25℃培養(yǎng) 7,14 d后觀察記錄菌落特征.6株紅曲菌在MEA和 CYA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 14 d的代表性菌落特征見表 7;在 CYA,MEA,PDA培養(yǎng)基上的代表性菌落特征見圖 2.

表 6 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株的氮源利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表 7 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌在MEA和 CYA培養(yǎng)基上的菌落特征 (14 d)

圖 2 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株在 CYA,MEA,PDA培養(yǎng)基上的菌落特征

6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株在 30℃下 PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng) 7 d,顯微鏡觀察菌絲形態(tài)、分生孢子形態(tài)及著生方式、閉囊殼特征等顯微形態(tài)特征,部分代表性結(jié)果如圖 3所示.

由圖 3可見紅曲菌各菌株的典型顯微形態(tài)特征:閉囊殼為橢球形 (見圖 3(a)),直徑為 20～50 μm,閉囊殼內(nèi)散生眾多子囊,成熟后子囊壁解體,孢子剩留在薄壁的子囊殼內(nèi);分生孢子梗由菌絲生出,在其頂部產(chǎn)生分生孢子 (見圖 3(b)),形狀為梨形;菌絲直徑 2～7μm,具橫隔,分枝狀,含有空泡和一些色素顆粒 (見圖 3(c)).

圖 3 紅曲菌顯微形態(tài)特征

根據(jù) 6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株菌落特征和顯微特征,初步將 6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株鑒定為表 8所列的 4個種.

表 8 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株的鑒定結(jié)果

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)從 111株紅曲菌中最終篩選出一株多糖產(chǎn)量穩(wěn)定在 5.0 g/L以上的高產(chǎn)多糖紅曲菌株,其平均胞外多糖產(chǎn)量為 5.28 g/L,比目前國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道的高,而且該菌株在平板和搖瓶培養(yǎng)基中的生長速度快,在工業(yè)化生產(chǎn)中可以縮短發(fā)酵周期、節(jié)約生產(chǎn)成本.今后,本課題還將對該高產(chǎn)多糖紅曲菌株進(jìn)一步研究,提高多糖產(chǎn)量,確定其最佳發(fā)酵條件和最佳培養(yǎng)基配方,以期對紅

曲多糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ).雖然本文結(jié)合了較多的紅曲菌形態(tài)學(xué)鑒定資料并參考生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終將高產(chǎn)多糖的紅曲菌株MP-66鑒定為紫色紅曲菌,但形態(tài)學(xué)鑒定由于受環(huán)境因素的影響較大,存在一定的主觀性,因此本課題還將從分子水平對該菌株進(jìn)行屬種的確認(rèn).

目前市售的很多保健產(chǎn)品中都含有多糖成分,但大多集中在靈芝多糖和香菇多糖等少數(shù)食用菌多糖上.張建峰[11]對紅曲多糖的免疫活性進(jìn)行了探索,結(jié)果表明紅曲多糖同其他真菌多糖一樣具有提高免疫力、保肝解毒等作用.浙江省是國內(nèi)紅曲分布較多的省份,因此,我們可以充分利用浙江省的紅曲資源,分離純化出高產(chǎn)多糖的紅曲菌菌株,并對其進(jìn)行屬種的鑒定,為今后進(jìn)一步研究紅曲多糖的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系、浙江省紅曲菌資源的分布及多樣性打下基礎(chǔ).

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