重組 GATA4腺病毒的構建及心肌細胞感染＊

李 濤, 胡曉青, 姜科聲, 周春燕

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院,浙江金華 321004;2.北京大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系,北京 100191)

GATA4是調控心臟基因表達的重要轉錄因子,參與了心臟的正常發(fā)育、起搏節(jié)律形成、功能基因表達和心肌肥大等生理、病理過程.

小鼠 GATA4的 mRNA早在交配后 7.0～7.5 d便可在胚胎心臟中胚層檢測到,并可持續(xù)表達,其蛋白質在心臟中胚層和原始心管的表達比心臟特異性收縮蛋白要早 6～12 h[1-2].GATA4缺失的小鼠在胚胎發(fā)育第 8～9天因心臟發(fā)育畸形和前腸腹側閉合缺陷而導致死亡,胚胎腹側不能融合而出現(xiàn)心管分叉,形成雙心管[3-4].GATA4在成年鼠中調控多種心臟結構基因,如α-肌球蛋白重鏈 (α-MHC)、心鈉素 (ANF)、腦鈉素 (BNP)等[2].GATA4是導致心肌肥大的一個關鍵性的轉錄因子[5].機械刺激或體液刺激可通過MAPK和ERK1/2通路激活 GATA4,GATA4與激活蛋白-1(AP-1)和活化 T細胞核因子 (NFAT)首先誘導c-fos和 c-jun表達,繼之使胚胎期基因α-MHC,ANF和 BN P表達增加,以及收縮蛋白基因如α-actin及內皮素 (ET-1)等基因表達上調,蛋白合成增加,細胞體積增大[5-7].此外,GATA4亦是重要的心肌抗凋亡分子,在阿霉素、柔毛霉素和氯化汞誘導凋亡時,GATA4被MAPK/ERK通路磷酸化,親核能力和轉錄活性增強,降解減慢,能夠誘導 Bcl-xL表達,發(fā)揮抗凋亡作用[8-12].在 B cl-2基因轉錄起始位點前 266 bp處含有一個保守的GATA位點,GATA4能夠激活 B cl-2表達,通過RNAi抑制乳鼠心肌細胞中 GATA4的表達,則Bcl-2的表達降低 48%[13].

關于 GATA4的功能研究正在逐步深入,但由于原代心肌細胞轉染效率低,難以進行常規(guī)轉基因操作,需要借助于病毒感染等方法實現(xiàn)GATA4在心肌細胞的過表達.本研究構建了 GATA4過表達的重組腺病毒,包裝病毒感染原代心肌細胞,從而為深入研究 GATA4的功能、挖掘 GATA4的下游靶基因提供了有力的轉基因工具.

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

含 GATA4 cDNA全長序列的 pCG-GATA4質粒由加拿大蒙特利爾大學 NemerM教授惠贈.腺病毒穿梭質粒 pAdTrackcmv,骨架質粒pAdEasy-1,JM109菌和BJ5183菌均為北京大學醫(yī)學院生化系保存.

1.2 質粒構建及 Ad-GATA4腺病毒包裝鑒定

使用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構建重組腺病毒,此系統(tǒng)由去除了 E1和 E3區(qū)的缺陷性腺病毒AdEasy-1和穿梭質粒 pAdTrackcmv組成.pCGGATA4質粒經限制性內切酶 XbaⅠ酶切,回收GATA4基因片段,pUC18載體連接.經 B amH Ⅰ和NotⅠ酶雙切鑒定插入方向后,將正向插入GATA4基因的 pUC18-GATA4載體行 BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切,釋放目的片段,與經 B glⅡ和 SalⅠ酶切線性化的 pAdTrack連接,轉化挑選克隆后經XbaⅠ酶切鑒定.正確插入目的片段的pAdTrackcmv-GATA4穿梭質粒用 Pm eⅠ進行線性化并經凝膠回收,再轉入到攜帶腺病毒骨架載體 pAdEasy-1的 E.coli.BJ5183菌株進行細菌內重組.利用卡那霉素抗性和 PacⅠ酶切鑒定,獲得重組正確的 pAd-GATA4腺病毒質粒.提取質粒DNA后,PacⅠ酶切線性化,按照 lipofectamine 2000說明書轉入 293A細胞中進行病毒包裝.分別于感染后 2,4,7,14 d在熒光顯微鏡下連續(xù)觀察病毒噬斑的變化;14 d后收集細胞,液氮反復凍融細胞 4次,1 000 r/min離心 10 min后收集上清液.利用收集的病毒重復感染 293A細胞擴增病毒.倍比稀釋后感染 293A細胞,24 h后熒光顯微鏡觀察,按發(fā)熒光細胞數(shù) ×稀釋度 /病毒液體積計算病毒滴度.對照病毒為北京大學醫(yī)學院生化系既往構建.

1.3 Western blot檢測 GATA4表達

重組 Ad-GATA4腺病毒的鑒定:HeLa細胞接種于 24孔板上,培養(yǎng)過夜后分別加入 100感染復數(shù)(multiplicity of infection,MO I)的病毒液,48 h后棄培養(yǎng)液,提取蛋白,BCA(Bicinchoninic acid)法蛋白定量.30μg蛋白樣本中加入 2×上樣緩沖液,煮沸后,12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE),電轉膜,5%脫脂奶粉封閉1 h后加入抗 GATA4或抗 GAPDH抗體 (體積比1∶1 000)進行雜交,辣根過氧化物酶 (HRP)標記的二抗以1∶2 000稀釋,用化學發(fā)光法進行顯色.同樣的方法對乳鼠心肌細胞病毒感染后進行檢測.蛋白條帶經灰度掃描后由Multi Gauge軟件(v3.0)進行半定量分析.

1.4 乳鼠心肌細胞離體培養(yǎng)及感染

出生 1～3 d的大鼠,無菌操作下取出心臟,剪除心房,將心室放于含 0.1%胰蛋白酶和0.05% Ⅰ型膠原酶的消化液中,剪碎后置于 4℃冰箱消化 1 h,離心,加入含 5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基制成細胞懸液,以差速貼壁法取心肌細胞,將細胞密度調至 5×105～6×105細胞 /mL,接種于 12孔板中,37℃,5%CO2,繼續(xù)培養(yǎng)至 24 h后見細胞搏動.

待細胞穩(wěn)定生長 24～48 h后,感染不同MO I的腺病毒,24 h后熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光表達效率和細胞形態(tài)變化,選擇最適感染劑量.Hoechst 33342復染 1 h顯示細胞核的形態(tài),Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡下隨機選取 5個視野拍照,隨機選擇 5～10個細胞測量發(fā)光心肌細胞的表面積.

1.5 實時定量聚合酶鏈反應 (Real-time PCR)

按照 Trizol試劑說明書提取細胞的總 RNA,取 4μg經 AMV逆轉錄酶逆轉錄成 cDNA作為PCR的模板.將 4μg總 RNA與 2μL隨機引物溶液 (0.5μg/μL)混合,加焦碳酸二乙酯 (DEPC)處理水補足至終體積為12.5μL,70℃水浴變性5 min,置冰上 5 min.每管中再加入下列試劑:4μL反應緩沖液,2μL三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)溶液 (10 mmol/L),0.5μL核糖核酸酶抑制劑 (RNasin)溶液 (40 U/μL),1μL AMV溶液(200 U/μL),加 DEPC處理水補足至 20μL后混勻,輕微離心,37℃反應 1 h,70℃滅活 5 min,離心 1 min,-80℃保存?zhèn)溆?采用 TOYOBO公司的SYBR Green Real-time PCR MasterMix在AB I7700型定量 PCR儀上進行 PCR反應.反應體系如下:7.5μL 2×SYBR Green Master Mix buffer試劑,0.25μL正向引物溶液 (10 pmol/μL),0.25μL反向引物溶液 (10 pmol/μL),1μL cDNA模板溶液,滅菌去離子水補足至 15μL.PCR反應條件:95℃變性 10 min,95℃15 s,60℃ 1 min,40循環(huán).測定樣品的循環(huán)閾值 (Cycle threshold,Ct),通過計算 2-ΔΔCt比較不同樣品之間特定基因的表達AN F基 因 正 向 引 物 為 5′-ATCTGATGGATTTCAAGAACC-3′,反 向 引 物 為 5′-CTCTGAGACGGGTTGACTTC-3′;GAPDH基因正向引物為 5′-GCACCACCAACTGCTTAGC-3′,反向引物為5′-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3′.

1.6 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以 x ±s表示,采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行 t檢驗和單因素方差分析.

2 結 果

2.1 重組 GATA4腺病毒質粒的構建及鑒定

pCG-GATA4質粒經 XbaⅠ單酶切后釋放2.6 kb的 GATA4表達片段,在紫外燈下切下該片段,與 XbaⅠ單酶切的 pUC18載體連接.由于GATA4編碼基因于 350 bp左右處含一內源 N otⅠ酶切位點,因此由 B amH Ⅰ和 N otⅠ雙酶切判別GATA4基因在 pUC18載體中的插入方向,正向插入的重組質粒經雙酶切將釋放一約 350 bp的片段,反向插入將釋放一約 2.2 kb的片段.因此,經鑒定 4號克隆為正向克隆 (見圖 1(a)).將克隆方向正確的 pUC18-GATA4質粒經 B amHⅠ和SalⅠ雙酶切釋放 GATA4基因片段;同時,將pAdTrackcmv骨架質粒使用 B glⅡ和 SalⅠ雙酶切,使其線性化,同樣在紫外燈下切下該片段.上述DNA片段均經凝膠回收、連接、轉化至 JM109感受態(tài)細菌中,過夜培養(yǎng)挑選克隆,繼續(xù)培養(yǎng)單克隆轉化菌,小量提取質粒 DNA.

為了鑒定 GATA4片段是否插入 pAdTrackcmv骨架質粒中,需要進行酶切鑒定.由于 pAdTrackcmv-GATA4質粒中 BglⅡ位點已遭破壞,故使用GATA4片段內部酶切位點 XbaⅠ進行鑒定.質粒經 XbaⅠ酶切后鑒定結果如圖 1(b)所示,可知:克隆 2,3,4均為正確插入 GATA4片段的克隆.

pAdTrackcmv-GATA4經 Pm eⅠ線性化,轉入事先轉入腺病毒骨架質粒 pAdEasy-1的 BJ5183菌進行同源重組,經卡那霉素篩選,重組克隆經PacⅠ酶切鑒定.正確重組的質?？汕谐?3.0或4.5 kb的片段.酶切結果見圖 1(c),陽性克隆切 出 4.5 kb的片段,pAd-GATA4質粒構建成功.

圖 1 pAd-GATA4質粒的構建及鑒定

2.2 重組 GATA4腺病毒的包裝

將經過 PacⅠ線性化的 pAd-GATA4質粒轉染 293A細胞進行包裝.轉染后熒光顯微鏡下觀察病毒噬斑:2 d起逐步出現(xiàn)噬斑;14 d后有大量的病毒噬斑形成 (見圖 2),293A大量表達增強型綠色熒光蛋白 (EGFP),形態(tài)變圓并且呈漂浮狀態(tài).此時收獲細胞裂解后繼續(xù)感染 293A細胞,擴增病毒,倍比稀釋法測定病毒滴度,重組Ad-GATA4滴度為 6×1011efu/mL.

圖 2 原代病毒包裝

2.3 GATA4重組腺病毒的鑒定

為了進一步對 Ad-GATA4腺病毒進行鑒定,將 Ad-GATA4腺病毒感染無內源性 GATA4表達的 HeLa細胞,并通過蛋白質印跡法 (Western blot)檢測發(fā)現(xiàn) GATA4的表達 (見圖 3),而未感染病毒的 HeLa細胞及感染對照病毒的細胞均未檢測到 GATA4表達.

圖 3 Western blot法檢測 GATA4蛋白表達

2.4 GATA4重組腺病毒感染乳鼠心肌細胞

胰酶消化和差速貼壁法分離乳鼠心肌細胞,細胞形態(tài)呈短桿分支狀,有自發(fā)搏動.原代乳鼠心肌細胞生長 24～48 h,狀態(tài)穩(wěn)定后按MO I為 100的病毒量感染乳鼠心肌細胞,激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) 80%以上的細胞表達 EGFP,發(fā)光細胞形態(tài)清晰,表明感染成功,且結果顯示 Ad-GATA4誘導心肌細胞表面積明顯增加,肌纖維更加豐富(見圖 4).隨機挑選視野測定細胞表面積,對照病毒感染的心肌細胞表面積為 (360±104)μm2,感染 GATA4病毒的心肌細胞表面積為 (489±124)μm2(見圖 5(a)).提取蛋白檢測發(fā)現(xiàn),Ad-GATA4感染后心肌細胞 GATA4蛋白表達上升 2.3倍(P<0.01.見圖 5(b)).提取 RNA進行實時定量PCR檢測 GATA4下游基因 ANF表達,以 GAPDH作為內參,結果顯示 Ad-GATA4組 ANF表達明顯增強,比 Ad-Con組高 6倍 (P<0.01.見圖 5(c)).這些結果表明 Ad-GATA4腺病毒成功感染大鼠心肌并誘導了其心肌肥大表型的出現(xiàn).

圖 4 Ad-GATA4感染乳鼠心肌細胞激光共聚焦顯微鏡觀察圖

圖 5 乳鼠心肌細胞肥大指標的檢測

3 討 論

由于常規(guī)方法如磷酸鈣、脂質體法轉染原代心肌細胞效率低下,逆轉錄病毒又無法感染非增殖細胞,而攜帶外源基因的腺病毒或慢病毒則可高效感染非增殖細胞,因而成為研究心肌細胞病理生理變化的有效轉基因工具.本實驗成功地包裝重組 GATA4腺病毒,感染原代乳鼠心肌細胞,并結合 EGFP的表達,可方便有效地檢測到細胞呈現(xiàn)肥大表型,細胞表面積增大,心肌胚胎期基因ANF表達增高.

重組 GATA4病毒可應用于多個研究領域,如干細胞向心肌細胞的誘導分化、抗缺血凋亡及心肌梗死后心肌重構與修復、心肌肥大機制研究等.

既往研究認為 GATA4是心肌細胞分化發(fā)育的關鍵基因,GATA4基因缺失可致胚胎死亡,而不同位點的錯義突變導致心臟發(fā)育畸形,與臨床先天性心臟病的發(fā)生密切相關.在干細胞誘導分化領域的研究表明,GATA4過表達可促進 P19畸胎瘤干細胞及胚胎干細胞向自發(fā)搏動的心肌細胞定向分化[14].骨髓間充質干細胞在體內心肌微環(huán)境的誘導下能夠分化為心肌細胞,心肌梗死區(qū)局部注射能有效改善心功能指標.過表達 GATA4誘導臍帶血干細胞及誘導多能干細胞 (iPS cells)向心肌的特異定向分化正在研究之中.如果通過轉基因技術轉入 GATA4因子或其他心肌關鍵因子,將可能增加干細胞誘導分化效率[15-17].

心肌細胞凋亡可見于各種心臟疾病,如缺血性心肌梗死、高糖性心肌重構、蒽環(huán)類抗癌劑致心肌毒性.GATA4具有較強的抗凋亡作用,可能與其上調抗凋亡基因 Bcl-2和 B cl-xL有關.此外,GATA4亦具有抗內質網應激及調節(jié)自噬的作用[18-19].文獻 [20]構建了 GATA4與穿膜蛋白VP22的融合蛋白表達載體,穩(wěn)定轉染心肌成纖維細胞,然后注射到左室冠脈前降支結扎模型大鼠的心肌梗死區(qū),移植 6周后,發(fā)現(xiàn)能夠縮小梗死區(qū)面積,誘導周邊區(qū)代償性肥大,減輕病理性重構,恢復心功能.本研究構建的重組 GATA4病毒是否有助于改善心肌梗死后的心功能,有待進一步實驗研究.

GATA4是一個重要的心肌肥大相關轉錄因子.心肌肥厚是心肌細胞體積增大而不是心肌細胞增殖,盡管最初的心肌肥厚能夠增加損傷心肌的心排出量,但是長期心肌肥厚最終會導致心臟功能喪失代償而發(fā)生心排出量降低,失代償后發(fā)

生心力衰竭,并可發(fā)生擴張性心肌病、心肌梗死、心律失常和猝死.因此,確定心臟肥大的分子機制非常重要,將有助于找到預防和治療的有效措施.實驗證明 GATA4的過度表達能誘導心肌肥厚,但機制尚不完全清晰.本研究所構建的重組 GATA4腺病毒提供了良好的轉基因工具,將有助于心肌肥大分子機制的研究,挖掘 GATA4下游靶基因.

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