早期糖尿病大鼠晶狀體和視網(wǎng)膜水通道蛋白4表達的研究

黃 焱 韓咪莎 鄭衛(wèi)東 徐國興

早期糖尿病大鼠晶狀體和視網(wǎng)膜水通道蛋白4表達的研究

黃 焱1＊韓咪莎2鄭衛(wèi)東3徐國興3

（1福建醫(yī)科大學醫(yī)技學院眼視光學系；2基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系；3附屬第一醫(yī)院眼科，福州 350004）

目的 觀察早期糖尿病大鼠晶狀體、視網(wǎng)膜水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP-4）表達的變化，探討糖尿病大鼠眼組織水代謝改變的機制。方法 SD大鼠分為正常對照組和糖尿病組。制作糖尿病大鼠模型，于第4、8周取材，用免疫組化法和計算機圖像分析系統(tǒng)半定量分析各組大鼠晶狀體、視網(wǎng)膜AQP-4表達的變化。結果 正常及糖尿病大鼠AQP-4在晶狀體上皮均無表達。AQP-4在視網(wǎng)膜上有表達，正常大鼠主要表達于視網(wǎng)膜視桿視錐層、節(jié)細胞層和神經纖維層，糖尿病大鼠從內界膜延伸至視細胞層整個視網(wǎng)膜厚度均可見AQP-4陽性表達，特別是在神經節(jié)細胞層毛細血管內皮和神經纖維層陽性表達更明顯。糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織AQP-4陽性表達標隨周齡的延長而增強。結論 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AQP-4的表達較正常組增強，提示水通道蛋白的表達增加是糖尿病早期發(fā)生視網(wǎng)膜水腫的機制之一。

糖尿??；視網(wǎng)膜；晶狀體上皮；水通道蛋白4

角膜、晶狀體、玻璃體等都是含水很豐富的器官，它們的生理功能的完成依賴于細胞水轉運的平衡。多種類型的水通道蛋白分布在眼組織，與維持水的正常轉運有密切的關系。糖尿病眼病早期病變是否與細胞水轉運的平衡失調有關？水通道蛋白表達有何變化？這些問題目前未見報道。本研究通過免疫組織化學法和計算機圖像分析技術對AQP4在晶狀體和視網(wǎng)膜中的分布作定性定量研究，觀察糖尿病大鼠早期是否有AQP4的異常表達，探討AQP4在糖尿病白內障和視網(wǎng)膜病等并發(fā)癥中可能發(fā)揮的作用，為糖尿病眼病的早期防治提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.實驗動物

成年SD（Spague-Darley）大鼠30只，由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供。雄性，體重200-220g。自由攝食、飲水，室溫飼養(yǎng)。

2.主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ min≥98.89，SigmaS0130）購自Sigma公司，用羅氏血糖儀測血糖。普通飼料由福建醫(yī)科大學動物實驗中心提供。兔抗鼠水通道蛋白4（AQP4）購自武漢博士德生物工程有限公司，SP免疫組織化學試劑盒及DAB顯色試劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。光學顯微鏡及攝像系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

3.糖尿病大鼠模型的制備

SD大鼠30只，適應性飼養(yǎng)7d，測空腹血糖均低于7mmol／L，隨機分為正常對照組（C組）10只，實驗組20只。實驗組用STZ誘發(fā)糖尿病，STZ臨用前用0.1mol／L檸檬酸緩沖液配成1%濃度，經微孔濾膜過濾滅菌，按60mg／Kg左下腹腔注射。72h后取尾血測空腹血糖。凡血糖≥16.7mmol／L，為誘導成功的糖尿病大鼠，共有18只大鼠成模，隨機分為A組和B組，A組于成模后飼養(yǎng)4周，B組于成模后飼養(yǎng)8周，取材用于下述實驗。實驗期間大鼠自由飲水、攝食，每周測量血糖1次，其中B組1只糖尿病大鼠在飼養(yǎng)6周時死亡。

4.免疫組織化學染色及計算機圖像分析

大鼠以腹腔注射水合氯醛麻醉，摘除雙側眼球，經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，6μm連續(xù)切片。SP染色主要步驟：切片脫蠟水化后，以檸檬酸緩沖液高溫修復抗原，入0.3%H2O210min，3%正常血清孵育10min，兔抗水通道蛋白4抗體孵育60min，HRP標記的羊抗鼠IgG孵育30min，DAB呈色，Mayer蘇木素復染。陰性對照片以PBS替代抗體，其余過程同上。棕褐色為免疫組織化學陽性染色。圖像分析：應用 Motic Images Advanced 3.0圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，測定陽性細胞的平均灰度值。在同一光強度、放大倍數(shù)下，10張切片每張切片隨機選取5個視野，對免疫組織化學陽性染色進行測定，灰度值（gray scale）與所含的陽性物質的總量成反比，即灰度值越大，陽性強度越弱。

5.統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用（ˉx±s）表示，組間差異選用最小顯著差法（LSD法），統(tǒng)計軟件是SPSS13.0軟件包。

結 果

1. 各組大鼠體重情況

A、B組攝食量、飲水量比C組明顯增加，而體重明顯下降，差異有顯著性（P＜0.05），且毛色粗糙發(fā)黃。

表1 各組大鼠體重（g）Table 1 Weight of rats in different groups（g）

2.各組大鼠空腹血糖情況：注射STZ后的A、 B組大鼠血糖明顯高于C組

表2 各組大鼠空腹血糖 （mmol／l）Table 2 Blood sugar of rats in different groups（mmol／l）

3.免疫組化結果：

AQP4在正常及糖尿病大鼠晶狀體上皮均無表達（見圖B，D）。AQP-4在視網(wǎng)膜上有表達，正常大鼠主要表達在內網(wǎng)層以內的細胞膜（見圖C），糖尿病大鼠從內界膜延伸至外界膜的整個視網(wǎng)膜厚度均可見AQP 4陽性表達，特別是在外網(wǎng)層、神經節(jié)細胞層毛細血管內皮和神經纖維層陽性表達更明顯。成模8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織AQP4陽性表達比成模4周的明顯增強（見圖D）。

大鼠視網(wǎng)膜AQP4陽性表達灰度值計算機圖像分析結果是：

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜AQP4陽性表達灰度值Table 3 MOD of AQP4Positive express in retina of different group rats

討 論

目前的研究表明，AQP4是視網(wǎng)膜內分布最多的水通道蛋白［1］。Jiang Li等［2］研究 AQP4基因缺失鼠的視網(wǎng)膜電流圖時發(fā)現(xiàn)其視網(wǎng)膜電流圖上b波的振幅有明顯的降低，說明AQP-4參與了視細胞的光電信號傳導，對維持視網(wǎng)膜的興奮性有重要作用。Hamann等［3］用免疫熒光、免疫印跡方法研究了人及大鼠眼組織中AQP1-5的表達，他們認為在視網(wǎng)膜上AQP4表達于緊靠雙極細胞的Müller細胞和星形膠質細胞，尤其是 Müller細胞包繞微血管周圍和毗鄰玻璃體的足突膜上表達最為豐富。視網(wǎng)膜Müller細胞是一種特殊的神經膠質細胞，也是視網(wǎng)膜內最主要的神經膠質細胞。而視網(wǎng)膜色素上皮細胞和視細胞上沒有AQP4表達。Iandiev［6］等報道4～6個月糖尿病大鼠內層視網(wǎng)膜AQP4的表達減弱而AQP1表達增強。本研究結果表明，正常大鼠視網(wǎng)膜主要在視桿視錐層、節(jié)細胞層和神經纖維層有AQP4表達，而1～2個月的早期糖尿病大鼠的整個視網(wǎng)膜從內界膜延伸至的視細胞層均可見AQP4陽性表達，特別是在神經節(jié)細胞層毛細血管內皮和神經纖維層陽性表達更明顯。本研究結果以Iandiev［4］等研究為基礎，補充了糖尿病大鼠早期的AQP4的表達情況，提示AQP4應該是在調節(jié)視網(wǎng)膜水腫過程中，有一個應激性的增高到逐漸降低的表達過程。

晶狀體的透明依賴于晶狀體纖維蛋白質、水、電解質等的正常生理代謝，晶狀體囊膜水通透性的改變是影響晶狀體透明的一個重要因素。關于AQP4在晶狀體是否有表達一直是有爭議的。2005年Nature［5］以封面形式報道了脂與蛋白質在Aquaporin-0相互作用的結構學機制，對人類了解白內障的關鍵機制有很大的促進作用。Hamann等［3］認為晶狀體纖維細胞膜上表達AQP0，晶狀體前囊膜上皮表達AQP1，沒有AQP4的表達。本實驗組經過多年研究，對眼的組織切片和免疫化學技術有較豐富的經驗，由于晶狀體的硬度很高，視網(wǎng)膜薄而軟，尤其是在進行免疫組化過程中的脫蠟和漂洗等步驟后，在同一張切片上保留視網(wǎng)膜和晶狀體的難度很高，這也是本研究的特色之一。本研究的結果就如圖D所示，在同樣一張切片同樣的染色方法和步驟，視網(wǎng)膜AQP4陽性表達很強而晶狀體沒有陽性表達的棕色呈現(xiàn)。本研究表明AQP4在正常及糖尿病大鼠的晶狀體上皆沒有表達。與Hamann等研究報道的一致。

研究通過免疫組化和圖像分析，明確了正常及早期糖尿病大鼠晶狀體上皮無AQP4的表達；正常視網(wǎng)膜AQP4有一定量的表達，早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AQP4的表達較正常組增強，可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變早期水腫的機制之一。目前對AQP4的研究主要在于確定其表達與視網(wǎng)膜水腫的形成相關，其在水腫發(fā)展及消退中的作用機制有待進一步研究。隨著對AQP4定位、功能和調控研究的進一步深入，AQP4可能會成為視網(wǎng)膜水腫的治療靶點，為有效預防和治療早期糖尿病視網(wǎng)膜病變提供新的策略。

［1］Goodyear MJ，Crewther SG，Junghans BM，et al.A role for aquaporin-4in fluid regulation in the inner retina.Vis Neurosci，2009，26（2）：159-165

［2］Jiang Li，Patil R V，Verkman A S，et al.Mildly abnormal retinal function in transgenic mice without Müller cell aquaporin-4water channels.J Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43（4）：573-579

［3］Hamann S，Zeuthen T，La Cour M，et al.Aquaporins in complex tissues：distribution of aquaporins 1-5in human and rat eye.Am J Physiol Cell Physiol，1998，274（5）：1332–1345

［4］Iandiev I，Pannicke T，Reichenbach A，et al.Diabetes alters the localization of glial aquaporins in rat retina.Neurosci Lett，2007，421（2）：132-136.

［5］Tamir Gonen，Yifan Cheng，Piotr Sliz，et al.Lipid–protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0crystals.Nature，2005，438（5）：633-638

大鼠視網(wǎng)膜和晶狀體上皮細胞免疫組化結果見圖A-D?！?00。

視網(wǎng)膜層次為：1視桿視錐層；2外界膜；3外核層；4外網(wǎng)層；5內核層；6內網(wǎng)層；7節(jié)細胞層；8神經纖維層；9晶狀體上皮層。

圖A 正常大鼠視網(wǎng)膜各層次，陰性對照

圖B 正常大鼠晶狀體上皮，未見AQP4陽性表達的棕色染色

圖C 正常大鼠視桿視錐層、節(jié)細胞層和神經纖維層可見少量AQP4陽性表達的棕色顆粒

圖D 糖尿病8周后大鼠晶狀體上皮仍未見AQP4陽性表達的棕色顆粒；視網(wǎng)膜各層可見大量AQP4強陽性表達的棕色染色

EXPLANATION OF FIGURES

Immunocytochemical localization of aquaporin4in retina and lens of rat eye（A-D）.Original magnification×400

Retinal layers are as follows：（1）rod-and-cone layer，（2）outer limiting membrane（3）outer nuclear layer，（4）outer plexiform layer，（5）inner nuclear layer，（6）inner plexiform layer，（7）ganglion cell layer，（8）nerve fiber layer，and（9）len epithelium.

Fig.A Retinal layers of normal rat，negative control.

Fig.B lenepithelium of normal rat，no AQP4expression.

Fig.C Retinal layers of normal rat，AQP4expressed on rod-and-cone layer，ganglion cell layer and nerve fiber layer，some brown dye.

Fig.D 8weeks-diabetic rats，no AQP4expression on len epithelium ，but AQP4strongly expressed on all layers of retina，much brown dye.

Expression of aquaporin-4 in retina and lens of early stage diabetic rats

Huang Yan1＊，Han Misha2，Zheng Weidong3，Xu Guoxing3
（1Department of Ophthalmology and Optometry；2Department of Human Anatomy，Histology and Embryology；3Department of Ophthalmology，The First Affiliated Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou350004，China）

ObjectiveTo investigate the changes of aquaporin-4（AQP4）expression in the retina and lens of early-stage diabetic rats，and study the pathological role of AQP4in water metabolism of diabetic rat eyes.MethodsSD rats were divided into a normal control group and a diabetic group.The diabetic model was induced by intraperitoneal STZ.Samples were collected 4and 8weeks later，and the expression of AQP4in lens and retina was observed by histochemistry and computer image semiquantitative analysis.ResultsThe expression of AQP4in the lens epithelium of both normal control and diabetic groups was negative.The outer and inner nuclear layer cells，the ganglion cells of the normal control rat retina showed positive immunoreactivity of AQP4.The positive reactivity of AQP4in the retina of early-stage diabetic rats was stronger than that of normal control rats.ConclusionThe expression of AQP4in the lens epithelium of both normal control and diabetic groups was negative.The expression of AQP4in the retina of early-stage diabetic rats was stronger than that of normal control rats，which shows that AQP4plays an import role in diabetic retinal edema.

Diabetes；Retina；Lens epithelium；Aquaporin-4

R329

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.008

2011-04-05

2011-08-01

福建省衛(wèi)生廳創(chuàng)新基金（2009CX-7）

黃焱，女（1971年），漢族，副教授。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）