貓下丘中央核5-HT、P物質(zhì)和星形膠質(zhì)細胞年齡相關變化

羅 勛 王 云 王春花 王順昌

貓下丘中央核5-HT、P物質(zhì)和星形膠質(zhì)細胞年齡相關變化

羅 勛＊王 云 王春花 王順昌

(淮南師范學院生命科學系,安徽232001)

目的 比較研究青年貓與老年貓下丘中央核(CIC)5-羥色氨(5-HT)、P物質(zhì)(SP)能神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞年齡性變化,探索老年個體聽力下降的神經(jīng)機制。方法 Nissl染色顯示下丘神經(jīng)元,免疫組織化學ABC法顯示5-HT、SP和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫反應(immunoreactive,IR)細胞。光鏡下觀察、拍照,對神經(jīng)元和5-HT、SP及 GFAP免疫反應細胞分別計數(shù)并換算成密度,測量其 IR細胞直徑取平均值,以及它們的陽性反應平均灰度值。結果 5-HT-IR、SP-IR和GFAP-IR細胞、陽性纖維及其終末在青年貓及老年貓下丘中央核均有分布。與青年貓相比,老年貓下丘中央核5-HT密度均顯著下降(P<0.01),胞體直徑明顯減小(P<0.01),陽性反應明顯減弱(陽性反應強度與灰度值呈負相關),SP-IR神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞密度卻顯著增大,陽性反應顯著增強。結論 在衰老過程中貓下丘神經(jīng)元尤其是5-HT能神經(jīng)元有顯著丟失現(xiàn)象,提示5-HT能神經(jīng)元顯著減少導致下丘聽覺信息傳遞功能減弱,可能引起老年個體聽覺功能衰退的重要原因;SP能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞密度顯著增大,可能起到延緩衰老的作用。

貓; 下丘中央核; 5-HT; P物質(zhì); 星形膠質(zhì)細胞

腦干聽覺中樞-下丘是皮層下聽覺信息加工處理的重要中繼站,分布著極為豐富的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞,且豐富的神經(jīng)元能合成和分泌多種遞質(zhì),如5-羥色氨(5-HT)和 P物質(zhì)(substance P,SP),對聽覺信息的傳遞和加工有重要作用。在衰老過程中,下丘組織結構的改變可能導致聽覺功能衰退。已有大量研究表明,下丘 GABA能神經(jīng)元顯著丟失及其功能異常可導致老年性個體嚴重聽覺障礙[1-4]。但對下丘5-HT、SP和星形膠質(zhì)細胞尚少見明確報道。本實驗通過定量比較,研究了青年貓與老年貓下丘中央核5-HT、P物質(zhì)和星形膠質(zhì)細胞年齡相關形態(tài)學變化,以期為聽覺功能衰退的神經(jīng)機制積累形態(tài)學資料。

材料和方法

1.材料及組織準備

選用經(jīng)聽覺檢查(耳蝸反射)無聽覺缺陷的青年貓(1-3齡,體重 2-2.5kg)和老年貓(11-13齡,體重3.0-3.5kg)各4只,鹽酸氯胺酮(40mg/kg體重)深度麻醉,開胸后經(jīng)左心室插管至升主動脈,灌注0.9%的生理鹽水,至肝臟發(fā)白后灌注含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(200ml/kg體重)進行預固定,開顱取出下丘,移入4%多聚甲醛中固定20-24h,PBS(0.1mol/L,p H7.4)沖洗,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋,作厚6 m的連續(xù)冠狀切片,裱片于APES處理的載玻片上,每隔10張切片取1張切片用于Nissl染色、相鄰切片用于免疫組織化學染色及陰性對照實驗。

2.神經(jīng)元Nissl染色

Nissl染色采用0.5%焦油紫染色。

3.免疫組織化學染色

石蠟切片脫蠟至水,3%H2O2室溫孵育5min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;蒸餾水沖洗,PBS浸泡5min;滴加正常山羊血清,室溫孵育10min,封閉非特異性反應部位;傾去血清,勿洗,滴加一抗(兔抗人5-HT多克隆抗體:稀釋比1:200),37℃孵育1h;PBS沖洗5min×3;滴加生物素標記二抗(羊抗兔Ig G抗血清),37℃孵育10min;PBS沖洗5min×3;滴加辣根酶標記鏈酶卵白素過氧化物酶工作液—三抗(ABC),37℃孵育10min,PBS沖洗5min×3;DAB顯色,自來水沖洗,脫水,透明,封片。陰性對照實驗采用正常山羊血清代替一抗,其余步驟同上。P物質(zhì)(稀釋比 1:200)和 GFAP(稀釋比 1:200)多克隆抗體染色方法同5-HT多克隆抗體。

實驗所用5-HT、P物質(zhì)和 GFAP兔抗人血清及配套的免疫組織化學SP試劑盒、DAB購于美國Labvision公司。

4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

染色后的切片在Olympus BX-51型熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)、測量、拍照,Nissl染色計神經(jīng)元密度,免疫組織化學染色計5-HT、P物質(zhì)能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞密度及其直徑。隨機選取20張切片,每張切片在光鏡(×200)下取 5個視野,利用 Image-Pro Express 5.1圖像分析軟件測量視野內(nèi)5-HT陽性細胞、P物質(zhì)陽性細胞和 GFAP陽性細胞密度;測量視野內(nèi)5-HT陽性細胞、P物質(zhì)陽性細胞和 GFAP陽性細胞直徑,取平均值(μm);測量視野內(nèi)5-HT、P物質(zhì)和 GFAP陽性反應灰度,取平均值。所有數(shù)據(jù)采用平均值±標準差(ˉx±SD)表示,用t-test進行各指標的顯著性檢驗。

結 果

1.神經(jīng)元(Nissl染色)

下丘中央核神經(jīng)元形態(tài)、大小不盡相同,有圓形、錐體形、卵圓形、三角形或多極形。胞體及樹突為藍色,其中以圓形較小的顆粒細胞為主(圖1,2)。統(tǒng)計結果表明,老年貓下丘中央核神經(jīng)元平均密度較青年貓的下降12.88%(見附表)[5]。

2.5 -HT、P物質(zhì)和GFAP(免疫組織化學染色)

下丘中央核5-HT、P物質(zhì)陽性反應神經(jīng)元分布均勻,胞體呈棕黃色,多為中等大小的圓形或橢圓形細胞,小部分為形態(tài)較大的圓形、橢圓形及多極形細胞(圖3,4,5,6)。統(tǒng)計結果顯示青年貓5-HT、P物質(zhì)能神經(jīng)元占神經(jīng)元總數(shù)的比例為20.43%、35.32%,老年個體的比例為17.08%、46.86%。老年貓下丘中央核5-HT陽性神經(jīng)元密度較青年貓的下降了27.18%,P物質(zhì)陽性神經(jīng)元密度較青年貓的增加了13.47%(見表1)。老年貓5-HT胞體直徑較青年貓的減小了2.07μm;青年貓與老年貓的SP胞體直徑無顯著性差異(見表1)。老年貓星形膠質(zhì)細胞密度和直徑分別增加了41.48%、1.00μm(見表1)。此外,老年貓5-HT能神經(jīng)元與神經(jīng)元數(shù)的比例較青年貓下降了3.35%,P物質(zhì)能神經(jīng)元與神經(jīng)元數(shù)的比例較青年貓的增加了11.54%,以及老年貓5-HT陽性反應神經(jīng)元灰度值顯著增大及P物質(zhì)能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞灰度值明顯減小(見表2)。t檢驗表明,老年貓下丘中央核5-HT能神經(jīng)元數(shù)目顯著減少及 P物質(zhì)能神經(jīng)元數(shù)目則明顯增加(P<0.01)(見表1);5-HT陽性神經(jīng)元胞體平均直徑明顯減小(P<0.01)(見表1);5-HT灰度值顯著增大(P<0.01),P物質(zhì)和星形膠質(zhì)細胞陽性反應灰度值明顯減小 (P<0.01)(見表2)。

表1 青年貓和老年貓下丘中央核神經(jīng)元和5-HT、P物質(zhì)能神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞比較(ˉx±s)Table 1 A comparison on density and diameter of neurons and 5-HT,SPergic cells,and astrocytes in th ecenter of inferior colliculus of young and old cat(ˉx ±s)

表2 青年貓和老年貓下丘中央核神經(jīng)元和5-HT、P物質(zhì)、GFAP免疫陽性反應細胞平均灰度值比較(ˉx±s)Table 2 A comparison on average gray value of 5-HT,SP,and GFAPimmunoreactive cells in the center of inferior colliculus of young and old cats(ˉx ±s)

討 論

下丘是皮層下聽覺信息加工的重要中樞,在聽覺神經(jīng)沖動傳導的調(diào)節(jié)、聲源的定位以及音頻和音色的辨別等聽覺信息處理過程中起重要作用[6]。下丘核分為中央核、外核和背核三個亞部,中央核為聽覺核心投射的重要中繼核團,主要功能是處理聽覺信息[7]。

1.5 -羥色胺 (5-hydroxytryptamine,5-HT),又稱血清素(serotonin),是人體重要的活性物質(zhì),以色氨酸(tryptophan,Trp)為原料,首先在色氨酸羥化酶(tryptophanhydroxylase,TPH)作用下合成5-羥色胺酸,再在 5-羥色胺酸脫竣酶(5-hydrotryptophen decarboxylase,5-HTPDC)作用下將5-羥色氨酸合成5-HT。5-羥色胺是一種在生物體內(nèi)以神經(jīng)遞質(zhì)的形式存在的一元胺,可以從行為和內(nèi)分泌兩方面減小生物對外環(huán)境或生物自身生理變化的反應,調(diào)控生物體的情緒變化、體溫等。5-羥色胺缺乏會引起一系列的生理機能紊亂,在無脊椎動物和脊椎動物的研究中都表明,5-羥色胺合成于一系列神經(jīng)元中,這些神經(jīng)元有多樣化的突觸功能和突觸連接,在感覺信號的刺激下,5-羥色胺信號放大,達到抑制突觸易化和行為感受性的目的。已有研究顯示,秀麗線蟲5-羥色胺能神經(jīng)系統(tǒng)缺陷能夠引起感覺信號整合能力的下降;外源施加5-羥色胺可部分恢復5-羥色胺能神經(jīng)系統(tǒng)缺陷引起的感覺信號整合能力的下降,對于轉(zhuǎn)運再攝取與受體功能缺陷引起的下降卻無法恢復[8]。目前研究表明,5-HT耗竭大鼠應激時更容易產(chǎn)生抑郁和焦慮癥狀,并易導致學習、記憶等認知功能受損,對應激適應能力下降[9]。5-HT作為一種抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)[10-13],在下丘中廣泛存在,對傳入的聽覺信息發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn),5-HT在下丘中央核亦呈顯著的年齡性變化,即老年個體顯著減少。免疫組化研究發(fā)現(xiàn),5-HT陽性纖維和終末與 GABA胞能神經(jīng)元的胞體密切接觸[14]。結合生理學研究發(fā)現(xiàn),下丘中央核GABA能抑制性相對減弱可導致其聽空間反應閾擴大、方向敏感性下降,提示5-HT與 GABA對傳遞的信息起到共同的抑制作用,推測老年個體下丘中央核5-HT下降亦可能是聽覺功能減退的一個重要原因。

2.SP是一種神經(jīng)肽,是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì),廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),在一些DRG(dorsal root ganglia)神經(jīng)元的核周質(zhì)及神經(jīng)元到脊髓背根的神經(jīng)傳導通路上有很高的含量[15]。近年來研究表明,SP是一種肽能遞質(zhì),是感覺神經(jīng)的傳導物質(zhì),也是感覺神經(jīng)元生長、發(fā)育、成熟的標志,含SP的感覺性神經(jīng)末梢具有雙向傳導功能,在向中樞傳遞受刺激信息時起遞質(zhì)作用,在局部釋放 SP及其它肽類物質(zhì)時起調(diào)質(zhì)作用。SP既是初級感覺神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì),又是中樞感覺神經(jīng)細胞的神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì),參與聽覺信息的傳遞。已有研究發(fā)現(xiàn),SP能影響不同類型靶細胞的增殖,在皮膚損傷時期,SP參與局部炎癥反應及免疫反應,可促進創(chuàng)面的修復[16]。本實驗觀察顯示,老年貓下丘中央核SP含量明顯增加,表明在衰老過程中,SP對神經(jīng)元的損傷有修復作用,同時SP作為興奮性遞質(zhì),其含量顯著提高,結合已有研究顯示 GABA抑制性性遞質(zhì)的顯著下降[5],提示興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡被打破,聽覺信息的正常調(diào)制及傳輸受到影響。

3.膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)作為星形膠質(zhì)細胞(astrocyte,AS)特異性標志蛋白,可作為星形膠質(zhì)細胞分化和功能活性的指標。星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)系統(tǒng)中起支持、營養(yǎng)、代謝、合成、分泌、維持離子平衡等多種重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn),貓在衰老過程中AI區(qū)星形膠質(zhì)細胞的活動增強[17]。本研究結果與其一致,顯示老年貓下丘中央核星形膠質(zhì)細胞密度和直徑均顯著增大。膠質(zhì)細胞活動增強可能對衰老中下丘具有保護作用:填充神經(jīng)元凋亡所產(chǎn)生的基質(zhì)空缺,維持老年下丘的形態(tài);通過形成的血管周足吸收血液中的營養(yǎng)物質(zhì),為下丘提供大量營養(yǎng),并穩(wěn)定衰老中神經(jīng)元周圍的微環(huán)境,維持其正常的生理功能,延緩下丘進一步衰老。

總之,在衰老過程中,貓下丘中央核5-HT、SP、星形膠質(zhì)細胞,呈現(xiàn)顯著的年齡相關性變化,可能是導致老年個體聽力下降的重要原因。但本文僅僅比較分析了三者的變化及可能的生理作用,可導致其發(fā)生變化的原因,以及它們之間的作用機制等相關因素都有待進一步探討。

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圖 版 說 明

圖1 Nissl染色示青年貓下丘中央核神經(jīng)元。×200

圖2 Nissl染色示老年貓下丘中央核神經(jīng)元。×200

圖3 5-HT免疫組織化學反應示青年貓下丘中央核5-HT陽性反應神經(jīng)元,5-HT陽性反應神經(jīng)元(→)?！?00

圖4 5-HT免疫組織化學反應示老年貓下丘中央核5-HT陽性反應神經(jīng)元,5-HT陽性反應神經(jīng)元(→)。×200

圖5 SP免疫組織化學反應示青年貓下丘中央核SP陽性反應神經(jīng)元,SP陽性反應神經(jīng)元(→)?！?00

圖6 SP免疫組織化學反應示青年貓下丘中央核 GABAergic能神經(jīng)元,SP陽性反應神經(jīng)元(→)?！?00

圖7 GFAP免疫組織化學反應示青年貓下丘中央核星形角質(zhì)細胞,星形膠質(zhì)細胞→)。×200

圖8 GFAP免疫組織化學反應示老年貓下丘中央核星形角質(zhì)細胞,星形角質(zhì)細胞(→)?！?00

EXPLANATIONOF FIGURES

Fig.1 Nissl staining to show neurons in the CIC of young cat.×200

Fig.2 Nissl staining to shows neurons in the CICof old cat.×200

Fig.3 5-HT immunoreaction to show 5-HT ergic cells in the CICof young cat,5-HT ergic cells(→). ×200

Fig.4 5-HT immunoreaction to show 5-HT ergic cells in the CICof old cat,5-HT ergic cells(→). ×200

Fig.5 SPimmunoreaction to show SPergic cells in the CICof young cat,SPergic cells(→). ×200

Fig.6 SPimmunoreaction to show SPergic cells in the CICof young cat,SPergic cells(→). ×200

Fig.7 GFAPimmunoreaction to show astrocytes in the CIC of young cat,astrocytes(→). ×200

Fig.8 GFAPimmunoreaction to show astrocytes in the CIC of old cat,astrocytes(→). ×200

Age-related changes of 5-HT,substance P,and astrocytes in infer ior colliculus center of cats

Luo Xun＊,Wang Yun,Wang Chunhua,Wang Shunchang
(Department of Lif e Science,Huainan Normal University,Anhui 232001,China)

Objective Age-related changes of 5-HT,SP,and astrocytes in the inferior colliculus of young adult and old cats were investigated comparatively,and the neural mechanism of the auditory degeneration during senescence underlying these changes was discussed.Methods Nissl staining was used to display all the inferior colliculus neurons,and immunohistochemical method was used to exhibit 5-HT immunoreactive(5-HT-IR)cells,substance Pimmunoreactive(SP-IR)cells,and astrocytes.Under the microscope,the number of the 5-HT-IR cells,SP-IR cells and astrocytes was counted,and their diameter and density were measured.Results The 5-HT-IR cells,SP-IR cells,astrocytes,fibers and their teminals were distributed widely in central neucli of inferior colliculus in young and old cats.The diameter and density of 5-HT-IR ergic neurons declined,while grey value significantly increased in the old cats when compared with those of the young adults.But SP-IR cells and astrocytes were on the contrary.Conclusion An evident loss of the 5-HT-IR neurons in old inferior colliculus may result in an imbalance of excitement and inhibition,which might be an important reason for the auditory degeneration in senescence.The f unctional increase of SPand astrocytes may delay aging.

Cat; Central of inferior colliculus(CIC); 5-hydroxytryptamine(5-HT);Substance P(SP); Astrocyte

R322.811

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.002

2011-01-14

2011-04-02

國家自然科學基金資助(20907016;21077040);安徽省自然科學基金資助(090413257);安徽省高等學校自然科學基金資助(ZD200909;KJ 2009B156)

羅勛,男(1972年),漢族,碩士,講師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)