花花柴耐鹽相關(guān)基因NHX的克隆與分析

李彬 康少鋒 張莉 鄧芳 王彥芹，3*

(1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)

(2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，四川溫江 611130)

(3 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)與利用重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

我國土地面積非常廣大，堪稱地大物博，但由于現(xiàn)代化建設(shè)和住房用地以及城市擴(kuò)張、自然災(zāi)害、土地沙漠化等諸多因素的影響可用耕地面積并不多，大多數(shù)土地由于鹽堿的危害而并不適于農(nóng)作物的生長，所以農(nóng)業(yè)發(fā)展也受到了相應(yīng)的限制。地處我國西部地區(qū)的新疆，土壤鹽漬化非常嚴(yán)重，但有一些植物卻能很好的生長，依據(jù)基因決定性狀，這些植物自身一定擁有豐富的能夠調(diào)節(jié)其在高鹽堿環(huán)境下生存的基因資源。充分挖掘這些耐鹽堿植物基因資源并將其進(jìn)行合理高效的利用，轉(zhuǎn)入在新疆大面積種植的棉花、旱稻、果樹等經(jīng)濟(jì)作物中，擴(kuò)大其種植面積，不僅可以改善當(dāng)?shù)厝说慕?jīng)濟(jì)收入問題，也將會為解決我國糧食生產(chǎn)、土地的利用率和環(huán)境保護(hù)等一系列社會問題起到巨大作用。

花花柴(Karelinia caspica)，菊科，多年生草本植物。具有泌鹽器官，屬于泌鹽生植物。鹽脅迫下，花花柴植株葉片肉質(zhì)化，而肉質(zhì)化是真鹽生植物的一個典型特征，故花花柴特殊的耐鹽機(jī)理值得研究。而Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白則是位于細(xì)胞的質(zhì)膜或者液泡膜上，PM－ATPase或V－ATPase和VPPase產(chǎn)生的跨膜H+梯度，可以將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+進(jìn)行外排或區(qū)隔化到液泡中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值和Na+濃度以及維持細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)等多種功能。擬南芥中AtNHX1基因是植物中最早克隆的編碼質(zhì)膜和液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因，隨后又在多種植物中相繼克隆得到了它們的同源基因。GeneBank數(shù)據(jù)庫中已有60多種植物中編碼NHX蛋白的220多條cDNA序列登錄?？偨Y(jié)前人研究成果，本研究將以新疆生長的耐鹽植物花花柴為材料，從中克隆相關(guān)的耐鹽基因NHX(控制Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白合成)并進(jìn)行簡單分析以便供人們參考，為后期進(jìn)行相關(guān)轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)，為提高農(nóng)作物的耐鹽特性提供候選基因及其轉(zhuǎn)基因材料等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

菊科植物花花柴(Karelinia caspia(Pall.)Less.)，采于新疆阿拉爾市塔里木河畔。2010年6月采集花花柴野生植株，采集前用5%NaCl溶液誘導(dǎo)4 d，取其葉片，提取總RNA。2010年10月采集了花花柴的種子，陰涼干燥處保存。種子消毒后，28℃條件下發(fā)芽，待幼苗長出真葉后用5%(w/v)NaCl溶液誘導(dǎo)4 d，取其葉片提取總RNA。

1.1.2 菌種及載體

E.coli DH10B，pMD18T－Vector購于 TaKaRa公司。

1.1.3 主要試劑及實驗儀器

試劑:TRNzol Reagent，Agarose，M －MLV Reverse Transcriptase， Ribonuclease Inhibitor， dNTP mixture;25mM，Sangon，DEPC，TaqDNAPolymerase，pMD18T － Vector，CaCl2，DNAMarkerDL2000

儀器:高速冷凍離心機(jī)，顯微移液器，電泳儀，凝膠成像儀，生物分光光度計，臥式冷凍冷藏轉(zhuǎn)換柜，PCR儀，制冰機(jī)

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

Oligo(dT)18采用TaKaRa公司網(wǎng)站發(fā)布序列。Actin primer采用馬清等［1］2009 年發(fā)表于《生物技術(shù)》的堿蓬(Suaeda glauca(Bunge)Bunge)Actin基因片段引物序列。

從NCBI/Nucleotide數(shù)據(jù)庫中搜索并下載已發(fā)表的編碼植物NHX基因的mRNA序列，然后分離ORF(open reading frame)序列。應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對，并應(yīng)用EMBL/ClustalW2構(gòu)建NHX基因同源進(jìn)化樹。本研究比對了矮牽牛(Petunia xhybrida，PhNHX1)，花花柴(Karelinia caspaca，NHX1，NHX2)，擬南芥(Arabidopsis thaliana，AtNHX1)，水稻(Oryza sativa，OsNHX1)，鹽角草(Salicornia europaea，SeNHX1)的 ORF，Identity=94.53%，保守區(qū)域長度為1653 bp，從ATG開始到TAA或TGA結(jié)束。根據(jù)保守區(qū)域兩端設(shè)計了適合于擴(kuò)增菊科科植物NHX基因的特異性引物。搜索分析了所有已報道的NHX基因序列的酶切位點種類，在設(shè)計的引物兩端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點HindⅢ和EcoR I。

引物:由上海捷瑞生物工程有限公司合成

Oligo(dT)18TTTTTTTTTTTTTTTTTT Actin primerP1:5’－GTGGTCGTACAACAGGTATTGTG－3’P2:5’－GACCCTCCAATCCAGACACTG－3’NHX primerP3:5’－CGAGGACGAATATTGGTTCTCTTGAGCTGG－3’P4:5’－CCCAGCCCCTGCTCCTAAAAGTGTGC－3’M13 primerP5:5’－CAGGAAACAGCTATGAC－3’P6:5’－GTAAAACGACGGCCAGT－3’

1.2.2 植物總RNA的提取

用Trizol法。

1.2.31 st－cDNA 的合成

1.2.3.1 Microtube 管中配制下列模板 RNA/引物混合液，總體系為12 μL。

1st－cDNA的合成反應(yīng)體系:Oligo(dT)18(50 μM)，2μL;total RNA，2 μg;ddH2O，up to 12

1.2.3.2 70℃保溫10 min后迅速在冰上急冷2 min以上。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液:RNA/引物變性溶液，12 μL;5× M － MLV Buffer，4 μL;dNTP Mixture(10 mM each)，1 μL;RNase Inhibitor(40 U/μL)，0.5 μL;RTase M － MLV(RNase H － )(200 U/μL)，1 μL;RNase Free Water，1.5 μL.

1.2.3.3 42 ℃保溫 75 min。

1.2.3.4 70 ℃保溫15 min 后冰上冷卻。

1.2.4 Actin 基因片段的克隆

1.2.4.1 Microtube管中配制下列 PCR 反應(yīng)液，總體系為 50 μL。

PCR反應(yīng)液:10×Buffer，5μL;MgCl2(25 mM)，4μL;dNTP Mixture(25 mM each)，0.5 μL;P1(25 μM)，0.5 μL，P2(25 μM)，0.5 μL;Taq DNA Polymerase(5 U/μL)，0.5 μL;1st－ cDNA，2.5 μL;ddH2O，36.5 μL.

1.2.4.2 按如下程序進(jìn)行PCR反應(yīng):

94 ℃，4 min，1 cycle;94 ℃，30 s ，52 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30 cycles;72 ℃，10 min，1 cycle;15℃，∞。

1.2.4.3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

制備1%瓊脂糖凝膠，以1×TAE Buffer為介質(zhì)，在5 V/cm的電場下電泳檢測PCR產(chǎn)物，以DNA Marker DL2000為標(biāo)準(zhǔn)物。

1.2.5 PCR擴(kuò)增NHX基因及目的片段的回收

1.2.5.1 Microtube管中配制下列 PCR 反應(yīng)液，總體系為 50 μL。

PCR 反應(yīng)液 :10 ×Buffer，5 μL;MgCl2(25 mM)，4μL;dNTP Mixture(25 mM each)，0.5 μL;P3(25 μM)，0.5 μL，P4(25 μM)，0.5 μL;Taq DNA Polymerase(5 U/μL)，0.5 μL;1st－ cDNA，2.5 μL;ddH2O，36.5 μL.

1.2.5.2 按如下程序進(jìn)行PCR反應(yīng):

94 ℃，4 min，1 cycle;94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，60 s，30 cycles;72 ℃，10 min，1 cycle;15℃，∞。

1.2.5.3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物及回收。

1.2.6 NHX基因PCR產(chǎn)物TA克隆及鑒定

1.2.6.1 連接反應(yīng)

Microtube管中配制下列連接反應(yīng)液，總體系為10 μL。

連接反應(yīng)液 :NHX，4.5 μL;pMD18T － Vector，0.3 μL;T4 DNA Ligase，0.2 μL;10 × T4 DNA Ligase Buffer，1.0 μL;ddH2O，4.0 μL。

16℃連接過夜，4℃放置，待轉(zhuǎn)化 E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.6.2 氯化鈣法制備 E.coli DH10B 感受態(tài)細(xì)胞

1.2.6.3熱激法轉(zhuǎn)化重組 DNA1.2.6.4重組質(zhì)粒構(gòu)建

圖1 pMD18T－NHX測序質(zhì)粒圖

測序質(zhì)粒的構(gòu)建利用的是 pMD18T－Vector(TaKaRa)，大小為2692 bp，目的基因大小為1253 bp，構(gòu)建成功的質(zhì)粒大小在3945 bp(圖1)。

1.2.6.5 陽性克隆的鑒定

(1)PCR鑒定

(2)酶切鑒定:

1.2.7 NHX 基因測序

取經(jīng)過PCR鑒定和質(zhì)粒酶切鑒定均符合要求的陽性菌落做成穿刺管菌種寄送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物總RNA的提取

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測花花柴總RNA結(jié)果如下:

圖2中，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道1和泳道2同為花花柴總RNA樣品。

由電泳圖可以看出，總RNA已提取到。點樣孔有熒光，說明總RNA樣品中存在蛋白質(zhì)雜質(zhì)。28 S與18 S條帶比例基本接近2∶1，說明RNA完整性較好，可用于反轉(zhuǎn)錄實驗。

2.2 1 st－cDNA的合成及Actin基因的克隆

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測Actin基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖3。圖3中M為DNA Marker DL2000，泳道1為花花柴Actin基因片段。

圖2 花花柴總RNA

圖3 花花柴Actin基因片段

圖4 擴(kuò)增目的條帶

圖 5NHX基因片段TA克隆質(zhì)粒

由圖可以看出，花花柴已擴(kuò)增到預(yù)期的598 bp的Actin基因片段，說明反轉(zhuǎn)錄合成1st－cDNA已成功。

2.3 PCR擴(kuò)增NHX基因

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示擴(kuò)增到預(yù)期的1253 bp的目的片段。

由圖4可以看到，已成功克隆到1253 bp的目的條帶。

2.4 NHX基因片段的TA克隆

2.4.1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測TA克隆質(zhì)粒如圖5。

圖6 NHX基因片段TA克隆質(zhì)粒PCR鑒定

圖7 酶切鑒定結(jié)果

圖5中，泳道2為花花柴NHX基因片段TA克隆質(zhì)粒。從圖5可以看出，TA克隆質(zhì)粒已成功提取到。

2.4.2 PCR鑒定 TA克隆質(zhì)粒，如圖6中，M 為DNA Marker DL2000泳道1，2為花花柴NHX基因片段TA克隆質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果。從圖6中可以看出，花花柴NHX基因片段TA克隆已成功。

2.4.3 酶切鑒定圖

圖7為克隆質(zhì)粒的酶切鑒定圖，泳道1－酶切質(zhì)粒，泳道2－重組質(zhì)粒。酶切結(jié)果顯示克隆成功。

2.5 花花柴NHX測序結(jié)果同源性比對

將花花柴 (Kareliniacaspaca，NHX)，(Karelinia caspaca，NHX1)，矮牽牛 (Petunia xhybrida，PhNHX1)，牽?；?Ipomoeanil，InNHX1)，胡楊(Populus euphratica ，NHX1)，擬南芥(Arabidopsis thaliana，AtNHX1)，水稻 (Oryza sativa，OsNHX1)，鹽角草 (Salicornia europaea，SeNHX1)，大腸桿菌 (Escherchia coli，NhaA/NhaB)，大麥 (Hordeum vulgare，HvNHX1)，鹽爪爪(Kalidiumfoliatum)，酵母(Saccharomyces cerevisiae，Nhap1)，灰綠藜(Chenopo diumglaucum， CgNHX1)， 人(Homosapiens，NHE2)的核酸序列利用生物學(xué)軟件DANMAN對測序結(jié)果進(jìn)行同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)獲得的基因與GeneBank上已經(jīng)提交的花花柴(Karelinia caspaca，NHX2)同源性高達(dá)81%。與鹽角草、鹽爪爪高耐鹽植物同源性達(dá)到68%，從基因的同源性比對分析來看本實驗克隆得到的是一個與已提交的NHX序列不同的新的序列。

2.6 構(gòu)建NHX基因的進(jìn)化樹

將測序結(jié)果與GeneBank中提交的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因用DNAMAN構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以大腸桿菌NHX基因作為外群，以大麥、水稻為代表的禾本科植物NHX基因與以灰綠藜、鹽角草、鹽爪爪為代表的藜科植物和茄科植物牽?；ǖ认啾龋谶M(jìn)化關(guān)系上更為原始。花花柴的NHX基因與茄科植物NHX基因處于同一個進(jìn)化分支，具有相近的親緣關(guān)系。本試驗研究所得到的花花柴基因與NCBI中已提交的花花柴NHX1、NHX2也存在細(xì)微差異，導(dǎo)致這種差異的結(jié)果可能是由不同地域環(huán)境下的個體差異所造成。

2.7 翻譯獲得氨基酸序列

對測序結(jié)果利用DNAMAN進(jìn)行翻譯獲得氨基酸序列。KcNHX的蛋白高度保守區(qū)均包括一個特殊的序列LFFIYLLPPI(圖8中加粗傾斜下劃線部分)，此序列已被證明在動植物的Na+/H+反向運輸體蛋白氨基酸組成中具有高度保守性，為氨氯吡嗪咪結(jié)合位點。

將本實驗獲得的核酸序列利用DNAMAN進(jìn)行翻譯成氨基酸序列，同花花柴(Karelinia caspaca，NHX1，DQ303231，NHX2，)，擬南芥 (Arabidopsis thaliana，AtNHX1)，牽?；?(Ipomoeanil，InNHX1)，胡楊(Populus euphratica，NHX1)，水稻(Oryza sativa，OsNHX1)，鹽角草 (Salicornia europaea ，SeNHX1)，大麥 (Hordeum vulgare，HvNHX1)，灰綠藜(Chenopo diumglaucum ，CgNHX1)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對結(jié)果。比對結(jié)果顯示一致性達(dá)到了68.77%，證明本次克隆得到的序列較好，可以用于構(gòu)建植物表達(dá)載體進(jìn)行相應(yīng)的功能鑒定。

3 討論

3.1 植物逆向轉(zhuǎn)運蛋白功能

NHX(Na+/H+antiporter)是液泡膜上的一種Na+/H+反向運輸體，能夠?qū)⒓?xì)胞質(zhì)中大量的Na+轉(zhuǎn)運入細(xì)胞質(zhì)，減輕鹽脅迫對植物的損害。已有的研究表明，擬南芥、油菜和番茄中過量表達(dá) At-NHX1，可在液泡膜中積累大量的運輸體，極大地提高了它們的耐鹽性［3］。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)還具有組織特異性。如NaCl脅迫下，擬南芥的AtNHX1基因在葉中的轉(zhuǎn)錄水平比對照高出4倍，而根中的轉(zhuǎn)錄水平則與對照幾乎沒有差異［2］。由于植物RNA表達(dá)具有時空特異性，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，菊科植物在其葉片中NHX的表達(dá)量受鹽脅迫變化最大。所以本研究直接采用經(jīng)過鹽脅迫處理的幼嫩花花柴葉片作為實驗材料。

3.2 PCR擴(kuò)增耐鹽相關(guān)基因NHX

PCR擴(kuò)增NHX基因過程中常遇到如下問題:一、引物與模板的互補(bǔ)性不好;二、退火溫度太低，非特性條帶很多。多次PCR結(jié)果表明，本研究所用的引物與模板的互補(bǔ)性不是很理想，PCR結(jié)果常常是沒有任何條帶。經(jīng)多次探索發(fā)現(xiàn)，增大反應(yīng)體系致50 μL，提高退火溫度，可以提高PCR的特異性。

圖8 翻譯獲得氨基酸

3.3 NHX基因片段的TA克隆

3.3.1 用于TA克隆的大腸桿菌菌株容易退化或突變，必須定期對其進(jìn)行分離純化。一般情況下，每半年即需對保存的菌種進(jìn)行一次純化。通常采用蘸取甘油菌在平板上進(jìn)行劃線分離，挑取單菌落接種液體培養(yǎng)基制成菌懸液后制備新的甘油菌菌種。劃線分離可多次重復(fù)進(jìn)行以便篩選活力較高菌株。

3.3.2 DNA重組必須在16℃的環(huán)境中進(jìn)行，連接時間以10～12 h為宜，轉(zhuǎn)化前在4℃環(huán)境中放置15 min，以便重組DNA能夠形成穩(wěn)定的cccDNA結(jié)構(gòu)，才能在宿主菌細(xì)胞中穩(wěn)定存在。

3.3.3 本研究采用將重組DNA轉(zhuǎn)化到生長活性更高的DH10B細(xì)胞中，利用抗生素篩選克隆，最后，根據(jù)T載體上M13引物序列采用PCR鑒定陽性克隆。實驗結(jié)果表明，選用DH10B作為宿主菌可縮短實驗時間約12 h，采用M13－PCR能更有效的鑒定陽性克隆，同時克隆質(zhì)粒可用于測序等其他實驗。

3.4 序列分析

KcNHX的蛋白高度保守區(qū)均包括一個特殊的序列LFFIYLLPPI，此序列已被證明在動植物的Na+/H+反向運輸體蛋白氨基酸組成中具有高度保守性，為氨氯吡嗪咪結(jié)合位點(氨基酸序列翻譯結(jié)果)，這表明KcNHX確實屬于NHX基因家族的不同成員，在植物體內(nèi)可能行使著不同的生理功能。此外，KcNHX與已克隆注冊的鹽生植物NHX基因同源性相差較遠(yuǎn)。分析原因可能是由于種屬的差異性及其耐鹽機(jī)制的特異性，灰綠黎(Chenopodium glaucum)屬于非肉質(zhì)化的泌鹽生植物，鹽角草(Salicorniaeuropaea)，鹽爪爪(Kalidium foliatum)屬于真鹽生植物，它們均屬于黎科。而花花柴屬于肉質(zhì)化的泌鹽生的菊科植物，NHX基因在這些植物不同的耐鹽機(jī)制中也許起著不同作用。

4 結(jié)論

4.1 本研究已成功提取了鹽生植物花花柴總RNA，并合成了1st－cDNA，成功克隆了花花柴的Actin基因片段，并從1st－cDNA中成功克隆到NHX基因，大小為1253 bp。將其與GeneBank中已經(jīng) 提 交 的Kareliniacaspaca，NHX1，NHX2;

Arabidopsisthaliana， AtNHX1;Ipomoeanil，InNHX1;Populus euphratica，NHX1;Oryza sativa，OsNHX1;Salicornia europaea，SeNHX1;Hordeum vulgare，HvNHX1;Chenopo diumglaucum ，CgNHX1的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對。結(jié)果顯示一致性達(dá)到68.77%，可以用于構(gòu)建植物表達(dá)載體進(jìn)行相應(yīng)的功能鑒定。

4.2 目前約有超過200個編碼Na+/H+反向運輸載體(Na+/H+hydrogen exchangers NHEs)已經(jīng)在GeneBank和Pfam的數(shù)據(jù)庫中注冊，該Na+/H+反向運輸載體廣泛存在于自然界各種生物，如原核生物霍亂弧菌(Tlibrio cholerae)，大腸桿菌(E.coli)，酵母，各類植物等，其主要可分為以下兩種:定位于質(zhì)膜上的一類和定位于胞質(zhì)內(nèi)膜系統(tǒng)(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體及植物中液泡)的一類。本研究所克隆的NHX基因?qū)儆诤笠活愋?，且已被報道在多種植物中存在，如擬南芥NHX基因家族AtNHX－6，水稻OsNHX1，鹽角草SeNHX等，這些植物分別屬于中生植物，甜土植物和鹽生植物。

4.3 鹽脅迫對植物的傷害主要來自2個方面:一是較高的鹽分降低了土壤水勢，從而抑制植物根系的吸水，引發(fā)滲透脅迫;二是過量的鹽分進(jìn)入植物細(xì)胞后，會破壞細(xì)胞質(zhì)的離子平衡，產(chǎn)生離子毒害［3］。其中，離子脅迫效應(yīng)是又高鹽分直接引起的，為鹽脅迫所特有。因此，如何消除離子脅迫效應(yīng)就成為了了解植物耐鹽性機(jī)理和培育耐鹽植物的關(guān)鍵。已有證據(jù)表明，這一過程主要是鹽離子的區(qū)隔化、鹽離子的外排和減少鹽離子的吸收等生理機(jī)制實現(xiàn)的［5］。其中，鹽離子的區(qū)隔化是鹽生植物消除離子脅迫效應(yīng)的核心機(jī)制，這一機(jī)制有位于液泡膜上H+－ATPase、H+－PPase 和 NHX 蛋白的建立的［4］。大量研究表明，過量表達(dá)NHX基因可以提高植物的耐鹽性［6，7］，說明NHX 基因是賦予植物耐鹽性的主要因素，具有廣泛的研究價值。本研究得到了花花柴NHX基因的cDNA片段，為進(jìn)一步分離該基因的全長序列奠定了基礎(chǔ)。對NHX基因的深入分析，不僅有利于了解花花柴的耐鹽性機(jī)理，有助于為耐鹽基因育種工作提供新的耐鹽基因資源。

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