血管環(huán)模型的研究進展

李秋影(綜述)，李欣欣，周王誼，莫紅梅，郭治昕※(審校)

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津300193;2.天津天士力研究院藥理毒理所，天津300410)

血管環(huán)研究起始于1980年，Robert F.Furchgott教授把血管條改成血管環(huán)模型，發(fā)現(xiàn)內皮細胞可釋放一種使血管舒張的因子，即一氧化氮(nitric oxide，NO)。他因而獲得了1998年度諾貝爾醫(yī)學獎。從此，離體血管環(huán)實驗在世界范圍內得到了廣泛的應用，用于基礎研究、新藥研發(fā)等領域。根據文獻的調研，目前國內開展血管環(huán)實驗研究的主要單位有以下7個:中南大學藥學院(發(fā)表文獻300篇)、北京大學醫(yī)學部(發(fā)表文獻247篇)、北京醫(yī)科大學病理生理教研室(發(fā)表文獻220篇)、中山大學醫(yī)學院藥理學研究室(發(fā)表文獻169篇)、同濟醫(yī)科大學藥理學教研室(發(fā)表文獻157篇)、中國藥科大學(發(fā)表文獻73篇)及第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院(發(fā)表文獻62篇)。

1 血管環(huán)的研究背景

血管環(huán)研究起始于研究血管釋放物質，發(fā)展30余年至今已發(fā)生了巨大的變化。在發(fā)展的過程中，很多變量和新的實驗方法被發(fā)明，并引入到后續(xù)研究之中。現(xiàn)已發(fā)展成為含有去內皮、無鈣、無氧等多種模型的一系列實驗平臺。血管環(huán)也從主動脈血管環(huán)擴展到肺動脈血管環(huán)、基底動脈環(huán)、腎動脈血管環(huán)等。隨著體外培養(yǎng)技術的發(fā)展，血管環(huán)還被用于觀察血管生成、腫瘤發(fā)生、遷移、浸潤機制等相關研究，并為開發(fā)抗腫瘤藥物提供了一個新的平臺。

血管環(huán)實驗的檢測指標，亦不再局限于血管的張力研究。在檢測方法上，生理記錄儀、比色法、酶聯(lián)免疫法、成像技術等均已廣泛應用在其中。

2 血管環(huán)的研究內容

血管環(huán)的研究分為兩大類:第一類為血管收縮活性研究，主要應用在心腦血管病變的探索上，檢測指標有血管張力，以及鈣離子、內皮素、NO、前列腺素E合成酶等調節(jié)因子;第二類為血管生成活性的研究，主要應用于抗腫瘤研究和傷口愈合及器官移植等方面，檢測指標有新毛細血管的生成數(shù)量，以及相關的調節(jié)因子的水平等。

2.1 血管收縮活性研究 各部位血管通過舒縮活動調節(jié)相應組織器官血流灌注，保證各組織器官正常的生理功能。當血管的舒縮活性出現(xiàn)異常時，機體也會發(fā)生相應的病理改變。因此，利用離體血管環(huán)來研究因血管活性異常而產生的各種疾病是一種不可多得的好方法。目前，胸主動脈環(huán)、腦基底動脈環(huán)在心腦血管藥物的作用機制研究中有著廣泛的應用。此外，血管內皮細胞在血管舒張中發(fā)揮著重要的作用，內皮細胞釋放NO及前列環(huán)素可引起血管舒張，對調節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用，因此血管環(huán)也用于血管內皮細胞完整性的評價。

2.1.1 高血壓研究 很多研究者將調節(jié)血壓的重任落到血管的舒張上，因此腎性高血壓、自發(fā)性高血壓、肺動脈高壓等疾病的作用機制以及相關的新藥開發(fā)領域，均充分利用血管環(huán)模型進行研究。

腎動脈張力是調節(jié)血管外周阻力的重要因素，腎血管阻力增高是高血壓病時腎血流動力學改變的重要特征。腎動脈的病變導致管腔的狹窄進而腎臟缺血刺激腎臟皮質內球旁裝置細胞分泌腎素過度，引發(fā)腎素血管緊張素系統(tǒng)過度激活，全身小動脈收縮血壓升高，導致腎血管性高血壓?？梢娔I動脈的張力在高血壓病和腎血管性高血壓的發(fā)病過程中起重要作用。離體腎動脈血管環(huán)為該領域提供了很好的工具。莊紅等［1］采用兩腎一夾高血壓大鼠模型，在造模8周后，取大鼠的離體主動脈，制成動脈環(huán)，觀察小分子活性肽Apelin對其的舒張作用。結果表明，Apelin-13具有顯著的舒張主動脈的作用，并且對高血壓大鼠血管環(huán)的舒張作用更強，提示Apelin-13在血管的保護作用中扮演著重要角色。

肺動脈高壓是慢性阻塞性肺疾病的病理生理關鍵環(huán)節(jié)。諸多致病因素參與了肺動脈高壓的發(fā)生與發(fā)展并最終引起血管收縮，導致血管重塑。肺動脈血管環(huán)已被廣泛地應用于抗肺動脈高壓藥物活性地評價。李倩等［2］通過組織浴槽血管環(huán)法觀察Kv3.4通道特異性阻斷劑 BDS-I對15-羥二十碳四烯酸(15-hydroxyeicosatetraenoic acid，15-HETE)收縮肺動脈血管的影響，15-HETE引起肺動脈血管環(huán)張力增加，呈劑量依賴性;對缺氧組的大鼠肺動脈血管環(huán)張力作用更為明顯，與對照組比較有顯著性差異;除去肺動脈血管內皮后，15-HETE引起血管收縮的強度較內皮完整時增強，呈劑量依賴性收縮反應;通過阻斷Kv3.4通道從而抑制收縮肺動脈血管環(huán)收縮。研究結果提示，Kv3.4通道參與由15-HETE引起的缺氧性肺動脈血管收縮。另有一項研究發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠和SD大鼠肺動脈血管環(huán)對缺氧(缺氧10 min)的反應不同，SD大鼠僅出現(xiàn)收縮反應，而Wistar大鼠在收縮前出現(xiàn)內皮依賴性舒張。

自發(fā)性高血壓領域的血管環(huán)實驗研究更多，大部分都是利用自發(fā)高血壓大鼠進行研究。待動物的血壓升高至一定的水平時，取材血管，制作血管環(huán)標本，進行實驗。Ishida等［3］從mRNA和蛋白質水平證實了G蛋白耦聯(lián)受體APJ及內源性配基Apelin在血管平滑肌有表達。Apelin可與血管內皮層的G蛋白耦聯(lián)受體APJ受體結合，激活一氧化氮合酶，釋放NO引起血管舒張，降低大鼠平均動脈血壓［4］。Apelin對于剝除內皮的離體隱靜脈也具有較強的收縮血管作用，其作用強度與AngⅡ相當。

劉廠輝等［5］研究G蛋白耦聯(lián)受體APJ的內源性配體Apelin-13對自發(fā)性高血壓大鼠離體血管環(huán)的血管收縮和舒張反應，以及與NO和細胞外信號調節(jié)激酶1/2信號轉導通路的關系。結果顯示，Apelin-13對于內皮完整的血管表現(xiàn)出濃度依賴性舒張作用。而對于去內皮血管則表現(xiàn)為收縮血管的作用。Apelin-13預孵育，可以減少自發(fā)性高血壓大鼠和同源的WKY大鼠血管對新福林的縮血管反應性，增加對乙酰膽堿的舒張反應性;進而證實了NO通路和細胞外信號調節(jié)激酶1/2信號轉導通路介導Apelin-13的舒張血管作用。

2.1.2 充血性心力衰竭 充血性心力衰竭的一個主要原因是體循環(huán)或者局部的血壓過高，因此對血管舒張活性的調節(jié)也是一個重要的方面。氨氯吡咪是一種保鉀利尿劑，臨床用于利尿消腫、心源性水腫和非心源性水腫的治療。陳媛等［6］采用KCl或者去甲腎上腺素預收縮的去內皮或者內皮完整的離體大鼠主動脈環(huán)，研究結果表明氨氯吡咪的血管舒張作用具有內皮依賴性，與內皮NO的合成有關;同時氨氯吡咪可能涉及血管平滑肌細胞的鈣激活鉀通道和內向整流鉀通道的激活。

2.1.3 冠心病 冠心病涉及小動脈的痙攣，如何防止痙攣并使之再舒張是防治冠心病的一大措施，相應血管環(huán)的研究也已經大量開展。王延震等［7］分離了老齡和幼年犬的冠狀動脈，進行17β-雌二醇對離體血管環(huán)收縮反應的研究，結果發(fā)現(xiàn)老齡犬冠狀動脈血管環(huán)對雌激素的敏感性遠遠低于幼年犬，電壓依賴性鈣通道明顯老化。

2.1.4 血管調控因子和離子通道研究 血管環(huán)的收縮舒張和很多血管調控因子有關，包括內皮性的各種因子，作用在平滑肌上的因子，以及鉀離子通道、鈣離子通道等。激活或者阻斷某些調控的途徑，可以引起血管的收縮或者舒張，因此利用血管環(huán)來進行機制研究也成為一種重要的手段。Francoise Goirand等采用C57B16小鼠來研究ATP依賴性蛋白激酶(AMP-dependent protein kinase，AMPK)亞型對小鼠胸主動脈的舒張作用。采用的小鼠是ATP依賴性蛋白激酶催化的 α1亞型缺失(AMPKα1－/－)或者ATP依賴性蛋白激酶催化的 α2亞型缺失小鼠，以及其同窩的對照小鼠。采用苯腎上腺素預收縮，然后加入梯度濃度的5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside，AICAR)來考察 AMPK 的活性。結果發(fā)現(xiàn)，AICAR可以劑量依賴性地舒張預收縮的C57B16、ATP依賴性蛋白激酶催化的α1亞型AMPKα1+/+和ATP依賴性蛋白激酶催化的α2亞型AMPKα2+/+無缺失的小鼠的動脈血管環(huán)，這個舒張作用并不被腺苷受體拮抗劑所阻斷。去除血管的內皮后，這個舒張作用依然存在，說明AICAR的作用靶點是平滑肌細胞。用L-單甲基精氨酸阻斷一氧化氮的合成后，AICAR仍然可以引起血管的舒張，說明它也不依靠一氧化氮系統(tǒng)來舒張血管。AMPKα1－/－小鼠的動脈環(huán)對AICAR沒有任何舒張反應，提示是AMPKα1的活性非內皮依賴性和非eNOS依賴性介導血管舒張作用［8］。

劉飛君等［9］利用大鼠腎動脈血管環(huán)、腹主動脈血管環(huán)、腦動脈環(huán)、冠狀動脈血管環(huán)探討藥物是否具有器官血管選擇性，結果發(fā)現(xiàn)KB-R7943濃度依賴性地舒張高鉀除極所致的成年大鼠各器官動脈血管環(huán)，對各臟器血管無顯著選擇性。

2.1.5 腦供血不足 腦血管的血流量巨大，缺氧及一些內源性物質可引起動脈痙攣，腦供血不足，最終導致腦組織缺血及變性壞死。Edvinsson等［10］采用大鼠腦動脈模型進行降鈣素基因相關肽抗體的研究，發(fā)現(xiàn)抗體的作用呈現(xiàn)內皮依賴性。作用于平滑肌細胞的α或β降鈣素基因相關肽均可引起大腦中動脈濃度依賴的血管舒張。

此外，還可利用家兔腦錐基底動脈環(huán)，研究各種因素引起的血管收縮反應的影響。

2.1.6 內毒素休克 內毒素休克(endotoxic shock，ES)可引起急性循環(huán)功能衰竭，其病理學基礎是細菌釋放內毒素導致全身炎性反應，肺臟首發(fā)受累，最終以急性呼吸窘迫綜合征、多系統(tǒng)器官功能衰竭危及患者生命。血管反應性改變是ES的主要病理特征之一。其中，血管對縮血管劑的反應性減弱或血管內皮依賴性舒張反應降低，都是血壓反應性下降及循環(huán)衰竭的重要原因之一，并與ES患者病死率居高不下密切相關。血管環(huán)可較直觀地顯示血管對各種活性物質的反應，因此已廣泛地應用到該領域。目前應用較多的是離體肺、體動脈血管環(huán)。

佟冬怡等［11］采用脂多糖孵育離體家兔肺動脈環(huán)和體動脈環(huán)建立ES模型。研究去甲腎上腺素和多巴胺對正常以及內毒素孵育后體動脈和肺動脈的血管張力反應性的變化。結果發(fā)現(xiàn)ES時，去甲腎上腺素在提升體動脈張力的同時，也同樣程度地提升肺動脈張力，二者無顯著性差異，對內毒素休克不利;而中劑量的多巴胺可使內毒素孵育肺動脈收縮減弱而體動脈收縮加強，對ES時的肺動脈高反應性和體動脈低反應性有利。

2.1.7 藥物作用機制研究 離體血管環(huán)也較廣泛地運用于藥物作用機制的研究，例如復方丹參滴丸、杭白菊總黃酮、參麥注射液、黃芪、金雀異黃素、苦碟子、滿山紅水提物等。

王紅娟等［12］利用家兔的主動脈血管環(huán)，對大豆黃酮的血管收縮作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)大豆黃酮通過激活內皮上的M受體釋放NO等引起舒張作用，該作用和膽堿能神經遞質乙酰膽堿相似，具有內皮依賴性。秦綱等［13］從疾病預防的角度出發(fā)，利用大鼠的離體胸主動脈，觀察大氣PM2.5(也稱細顆粒物，是指大氣中空氣動力學直徑＜2.5 μm的粒子，這種污染物主要產生于交通、制造、能源等行業(yè)的高溫燃燒過程中)。大量流行病學資料證明，PM2.5與心血管疾病發(fā)病、死亡密切相關。研究結果證明PM2.5可以加強PE對血管環(huán)的收縮作用，其機制可能與其通過氧化應激導致內皮細胞損傷有關。

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)是一種含硫有機化合物，因其能溶解絕大多數(shù)有機化合物，因此作為反應溶劑廣泛用于生物科研實驗。王葉紅等［14］研究了DMSO對離體大鼠胸主動脈的收縮反應，發(fā)現(xiàn)DMSO預處理后可以使氯化鈣的量效曲線右移，提示DMSO可能通過抑制血管平滑肌細胞的鈣離子通道而引起血管舒張。

2.2 血管生成活性研究 血管生成在很多生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤的生長和遷移，銀屑病的發(fā)病等都與血管生成具有很大的關系。因此，目前利用血管環(huán)進行血管生成活性研究也是熱點之一。近年來，評價抑制和促進血管生成的方法也有很大的進步，在分子水平、細胞水平、器官組織水平以及整體動物水平都建立了相應的模型，以評價血管生成的活性，形成機制以及藥物作用靶點等。細胞水平測定，包括血管內皮細胞模型［15］及內皮細胞和腫瘤細胞共培養(yǎng)模型［16］。在器官組織水平經典的血管生成模型主要有雞胚絨毛膜尿囊［17］、動物虹膜和無血管的角膜［18］等血管生成的體內器官組織模型。還有一種介于細胞水平和器官組織水平之間的培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)血管生成模型［19］。

2.2.1 抗腫瘤 血管生成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移等生物學過程中發(fā)揮重要作用。為了進一步研究腫瘤血管生成及其調控機制，分析血管生成促進或抑制因子活性的影響，驗證針對血管生成進行的腫瘤治療措施等，必須建立起腫瘤血管生成的研究模型。與體外實驗相比，在體的血管生成實驗雖然更貼近生理狀態(tài)，但是耗時、費力、昂貴。體外的血管環(huán)生成實驗已經被證明和生理狀態(tài)環(huán)境具有一定的吻合性。

1984年，Nicosia首次報道動脈環(huán)血管生成模型;1990年，Nicosia等［19］首次將此模型應用到血管發(fā)生的研究中。取下大鼠主動脈后，剪成1 mm寬的血管環(huán)，再用纖維蛋白膠或者膠原蛋白膠包埋，然后以無血清的MCDB131培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每天計算主動脈環(huán)產生的新生微血管數(shù)并進行定量分析。用不同膠培養(yǎng)的大鼠主動脈環(huán)新生血管的生長曲線不同。膠原包埋的主動脈環(huán)，培養(yǎng)1周時血管數(shù)達到頂峰，第2周開始萎縮。用纖維蛋白膠包埋時能使血管數(shù)頂峰期維持更長，且新生血管數(shù)是前者的2倍。

2002年Zhu等［20］將此方法改進，采用更薄的膠層包埋動脈環(huán)，使新生成血管染色更加方便;應用雙重染色法和共聚焦顯微鏡在同一個層面上觀察到內皮細胞、平滑肌細胞以及外周細胞共同存在并證明新生血管主要由內皮細胞構成。方法學的改進有利于血管生物學家更深入地研究血管生成的機制。動脈環(huán)取材廣泛，觀察方法簡單，可以從分子水平闡明血管生長的分子調控機制，是較好的體外血管生成模型。

2004年 Wang等［21］建立了一種簡明、可重復、可定量的新的技術來進行新生血管的定量分析，采用三維立體培養(yǎng)動脈環(huán)，用比色法來完成血管生成活性的定量測定。使用了常用的工具藥如舒拉明、紫杉酮等作為受試物，通過與成像分析方法結果的對比，比色法的結果被證明是穩(wěn)定可靠并可重復的。

2.2.2 動靜脈吻合 對大鼠動脈環(huán)和下腔靜脈環(huán)進行共培養(yǎng)，能形成微血管的吻合網絡，因此，可用此模型來研究動靜脈吻合發(fā)生的分子機制。但它不能完全真實反映腫瘤生長的微血管環(huán)境。另外，從不同種屬和不同大小的動物體內取出的動脈環(huán)血管生成數(shù)差別很大，不好類比［22］。

3 結語

在新藥的篩選和基礎研究中，血管環(huán)的研究都是一個很重要的位置。在體動物研究完全是生理狀態(tài)，可信度高，但是資源和時間方面耗資巨大。分子生物學和細胞學實驗耗資小，可以快速進行篩選，但是和生理狀態(tài)的差距過大，存在很大的局限性，而血管環(huán)這種半離體實驗，處于一個承接的位置。和離體心臟研究、離體臟器(肝、腎、肺)研究一起，成為一個器官篩選平臺，連接細胞學實驗(包括分子生物學)和整體動物實驗之間的通道，發(fā)揮著越來越重要的作用。血管環(huán)模型即將聯(lián)合分子生物學、細胞學等領域的先進技術，不斷改進創(chuàng)新，為相關科學研究提供更多的支持。

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