Collectrin的研究現(xiàn)狀

曹譯心，張 旭(綜述)，馬躍榮(審校)

(瀘州醫(yī)學(xué)院1組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，2病理學(xué)教研室，四川瀘州646000)

Collectrin基因分離克隆于1999年。Collectrin基因與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)具有高度同源性。目前研究發(fā)現(xiàn)Collectrin受肝細(xì)胞核因子(hepatocyte nuclear factor-1，HNF-1)調(diào)控，能與可溶性 NSF附著蛋白受體(soluble NSF attachment protein receptor，SNARE)復(fù)合體相互作用，在腎臟氨基酸及Na+轉(zhuǎn)運以及胰島素的分泌等方面具有重要作用。在此就Collectrin結(jié)構(gòu)及功能的研究現(xiàn)狀予以綜述。

1 Collectrin結(jié)構(gòu)及表達(dá)

Collectrin基因(原名NX-17，又名Tmem27)是于1999年在小鼠5/6腎切除后，腎小球的高濾過、高增生期的殘余腎臟組織中分離克隆的一個新的基因(GenBank 登錄號:AF178085)［1］?；虮磉_(dá)性研究已證實，該基因產(chǎn)物主要是特異性地表達(dá)于人、大鼠和小鼠腎臟近端小管和集合管［2］以及胰島 β細(xì)胞［3］。人和小鼠的Collectrin序列在核苷酸和氨基酸水平分別有86.9%和87.4%的同源性。人和小鼠Collectrin蛋白的一級結(jié)構(gòu)相似，氨基端位于細(xì)胞外，具有14個氨基酸組成的信號肽，羧基端位于細(xì)胞內(nèi)，跨膜區(qū)由23個氨基酸組成。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含127個氨基酸，并具有3個糖基化位點，提示Collectrin為Ia型跨膜糖蛋白［4］。人Collectrin與人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的同源基因(ACEH)及人ACE2具有高度同源性。Collectrin與ACE2的C端序列(包括部分細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)區(qū))具有47.8%的同源性［4，5］。Collectrin基因位于 X 染色體短臂2區(qū)2帶(Xp22)，與ACE2來源于同一個BAC克隆并分布于同一條染色體上，外顯子/內(nèi)含子染色體定位及結(jié)構(gòu)域分布提示Collectrin與ACE2及ACE來源于相同的祖先基因［6-8］。

在腎的發(fā)育過程中，在妊娠第13天可以測到mRNA信號，并且蛋白產(chǎn)物表達(dá)于輸尿管芽的分支。其后一直到新生兒期，其表達(dá)不斷增加，之后又逐漸減少［8］。通過分析Collectrin在非洲蟾蜍胚胎各個時期前腎的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Collectrin在整個前腎系統(tǒng)(包括近段、遠(yuǎn)段和中腎管)都高表達(dá)［9］。

2 Collectrin的功能

2.1 Collectrin在腎臟氨基酸轉(zhuǎn)運中的作用Malakauskas等［10］建立了 Collectrin基因剔除小鼠。發(fā)現(xiàn)Collectrin基因剔除小鼠出現(xiàn)明顯的氨基酸尿癥而使尿液濃縮能力下降。如果氨基酸尿癥狀明顯，將導(dǎo)致幾乎所有的氨基酸都丟失，以致形成顯著的結(jié)晶尿癥。Danilczyk等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Collectrin連同多種頂膜運載體形成一組腎臟的氨基酸轉(zhuǎn)運體。在爪蟾卵和犬腎傳代細(xì)胞中，Collectrin的表達(dá)通過B0AT1運載體加強了氨基酸轉(zhuǎn)運。Collectrin靶向斷裂小鼠因為頂膜的氨基酰轉(zhuǎn)運蛋白的下調(diào)而導(dǎo)致嚴(yán)重的腎氨基酸攝取障礙。Vanslambrouck等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育性亞氨基甘氨酸尿癥(即新生兒期生理性的亞氨基甘氨酸尿)中之所以會出現(xiàn)亞氨基甘氨酸尿，是因為在新生兒期集合管上皮細(xì)胞頂端缺乏Slc6a18、Slc6a19、Slc6a20a和輔助蛋白 Collectrin 的表達(dá)。亞氨基甘氨酸尿隨著它們表達(dá)的增加而使逐漸消退。Singer等［13］研究發(fā)現(xiàn)孤立轉(zhuǎn)運蛋白Slc6a18(XT2)具有Na+及Cl－依賴的中性氨基端轉(zhuǎn)運功能。而在腎臟中 XT2要發(fā)揮功能就必須在Collectrin的協(xié)助下才得以實現(xiàn)。上述研究均提示Collectrin和腎臟氨基酸的轉(zhuǎn)運有關(guān)，并且扮演十分重要的角色，如果Collectrin表達(dá)異常將導(dǎo)致嚴(yán)重的腎臟氨基酸重吸收障礙。

2.2 Collectrin 對胰島細(xì)胞的調(diào)控 Fukui等［3］和Yamagata等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠胰島瘤細(xì)胞系INS-1中或在轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島β細(xì)胞中Collectrin的過表達(dá)增強了葡萄糖刺激的胰島素分泌，但并不影響Ca2+入胞作用。相反地抑制Collectrin減弱了胰島素的分泌，說明Collectrin在體內(nèi)可以增強葡萄糖刺激的胰島素分泌。他們的研究還發(fā)現(xiàn)Collectrin通過與snapin(一種 SNAP-25結(jié)合蛋白)的相互作用和SNARE復(fù)合體結(jié)合，并且促進(jìn)SNARE復(fù)合體形成。因此，Collectrin是SNARE復(fù)合體功能調(diào)節(jié)器，并借此調(diào)控胰島素的外泌。Collectrin不僅可以增強胰島素的分泌，而且還可以刺激胰島 β細(xì)胞增殖。Akpinar等［15］發(fā)現(xiàn)，Collectrin 在 Tcf1－/－小鼠胰島 β細(xì)胞中的表達(dá)下降，但是在胰腺內(nèi)分泌部肥大模型(胰島肥大模型)小鼠的胰島β細(xì)胞中其表達(dá)升高。Collectrin形成二聚體，其細(xì)胞外區(qū)被糖基化、分離，并且從β細(xì)胞膜上脫落。這種分離過程只在β細(xì)胞才有，而不見于其他類型的細(xì)胞。全長Collectrin的過表達(dá)(而非截短了的Collectrin或可溶性蛋白)可增加其與胸腺嘧啶脫氧核苷的結(jié)合。相反，利用RNA干擾技術(shù)沉默Collectrin基因?qū)е录?xì)胞復(fù)制減少。Collectrin表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因小鼠其胰島β細(xì)胞群也增加。這些都提示，Collectrin能刺激胰島細(xì)胞的增殖。綜上，Collectrin在胰島素的分泌過程中直接或間接發(fā)揮了重要作用。

2.3 Collectrin可能在鹽敏感性高血壓中的鈉潴留中起主導(dǎo)作用 Yasuhara等［16］發(fā)現(xiàn)沉默 Collectrin表達(dá)將導(dǎo)致膜相關(guān)水通道2、α-上皮鈉通道以及H+-三磷酸腺苷酶的減少，Collectrin和SNARE復(fù)合體在大鼠的集合管內(nèi)大量表達(dá)。給予自發(fā)性高血壓大鼠和對照組大鼠正常鹽量飲食以及高鹽飲食10周，高鹽飲食組血壓顯著增高，雖然兩組均出現(xiàn)醛固酮尿排泄的顯著抑制，但Collectrin表達(dá)上調(diào)且和膜內(nèi)水通道2、α-上皮鈉通道以及H+-三磷酸腺苷酶的維持有關(guān);Collectrin啟動子活性、mRNA以及蛋白表達(dá)均上調(diào)，泛素化的Collectrin在高NaCl作用下減少，并且該結(jié)果不能夠被mIMCD-3細(xì)胞內(nèi)的醛固酮所改變。通過這項研究他們認(rèn)為，由非醛固酮依賴性高NaCl導(dǎo)致的Collectrin上調(diào)在功能上通過SNARE復(fù)合體與頂膜蛋白質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)聯(lián)，并且Collectrin可能在鹽敏感性高血壓中的鈉潴留中起主導(dǎo)作用。

2.4 Collectrin在正常腎臟結(jié)構(gòu)形成和維持中的作用 Collectrin位于靠近腎外周區(qū)的小囊泡并且結(jié)合于 γ-肌動蛋白-肌球蛋白Ⅱ-A、SNARE復(fù)合體和polycystin-2-polaris復(fù)合體，這些都和細(xì)胞內(nèi)小囊泡及膜蛋白的纖毛運動有關(guān)。在mIMCD3細(xì)胞系中沉默Collectrin可以引起其纖毛形成缺陷，導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加和凋亡，以及初級纖毛中的polycystin-2消失。抑制后腎培養(yǎng)細(xì)胞的Collectrin mRNA將導(dǎo)致在輸尿管芽分支中形成多發(fā)縱向的小囊。這些試驗結(jié)果提示，Collectrin是初級纖毛特異性膜蛋白recycling所必需的，它可以維持集合管初級纖毛的形成并保持極性［17］。張宏等［18］構(gòu)建了 Collectrin 的正、反義真核表達(dá)載體，然后他們將Collectrin的不同融合載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的集合管細(xì)胞，在不同時間點觀察不同融合基因的作用效果。結(jié)果表明，當(dāng)Collectrin表達(dá)被阻抑的情況下，細(xì)胞難以維持正常的生長而大量死亡;但是，Collectrin的過表達(dá)并未引起細(xì)胞的大量增殖。提示Collectrin可能為維持細(xì)胞正常生長、存活的基本元件，而并不在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.5 其他 張宏等［19］以 Collectrin為“誘餌”蛋白，應(yīng)用改進(jìn)的酵母雙雜交系統(tǒng)-酵母接合的方法，對正常人腎臟cDNA文庫進(jìn)行了篩選。獲得了與Collectrin存在直接相互作用的5種蛋白:氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白XAT2、精氨琥珀酸合成酶、鞘磷脂激活蛋白、金屬硫蛋白2A和NADH脫氫酶1。通過分析這些已知蛋白的功能信息，可以為尋找Collectrin的功能提供線索。Malakauskas等［20］報道，他們測量了Collectrin基因剔除小鼠［Collectrin(-/y)小鼠］胰腺的形態(tài)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)狀況，胰腺功能和離體胰島的葡萄糖刺激胰島素分泌試驗，發(fā)現(xiàn)Collectrin基因缺乏的小鼠通過多種機制來保護能量的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)以避免營養(yǎng)物質(zhì)流失。

3 Collectrin的調(diào)控

現(xiàn)有的研究表明，在體外Collectrin基因啟動子能被 HNF-1α 和 HNF-1β 激活［3，14］，阻斷 HNF-1 結(jié)合位點將使Collectrin的啟動子活性降低80%;在體內(nèi)Collectrin的表達(dá)受HNF-1α的調(diào)節(jié)，而不受HNF-1β的調(diào)節(jié)［14］。Yamagata 等［14］為了研究 Collectrin 和HNF-1α和 HNF-1β的生理功能，評估了 HNF-1α、HNF-1β和Collectrin在成年小鼠胰腺的表達(dá)模式。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，Collectrin表達(dá)在HNF-1α陽性的胰島細(xì)胞，而不表達(dá)于外分泌細(xì)胞。Collectrin同時也表達(dá)在HNF-1α陽性的形成中的小鼠胰腺。HNF-1β只表達(dá)于外分泌導(dǎo)管細(xì)胞，而不表達(dá)于內(nèi)分泌細(xì)胞。HNF-1β和Collectrin雙染顯示，Collectrin不表達(dá)于HNF-1β陽性細(xì)胞。這表明在體內(nèi)Collectrin的表達(dá)受HNF-1α的調(diào)節(jié)，而不受HNF-1β的調(diào)節(jié)。同樣，在腎臟，免疫組化也顯示Collectrin表達(dá)在HNF-1α陽性的細(xì)胞。這些都提示 HNF-1α可能是重要的Collectrin轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。此外，他們的研究還發(fā)現(xiàn)胰十二指腸同源盒基因1對Collectrin的轉(zhuǎn)錄也有調(diào)節(jié)作用，但是較HNF-1α弱。此外，Saisho等［21］研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖可以上調(diào) Collectrin蛋白在MIN6β細(xì)胞株的表達(dá)，而這一過程是通過線粒體的枸櫞酸循環(huán)中間體來介導(dǎo)的。由此可見，HNF-1是Collectrin最主要的調(diào)控因素，而調(diào)控是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上的。

4 結(jié)語

作為一個新近發(fā)現(xiàn)的在腎集合管上皮及胰島β細(xì)胞特異表達(dá)的蛋白，Collectrin有多種功能，其功能障礙參與了多種疾病的發(fā)生。在目前的研究成果里，最引人矚目的莫過于Collectrin參與腎臟氨基酸轉(zhuǎn)運及胰島素的分泌，但是其相關(guān)機制尚待進(jìn)一步的深入研究，相信當(dāng)相關(guān)機制研究清楚以后，必將為相應(yīng)的臨床疾病的診治提供新思路、新方法。

［1］Zhang H，Wada J，Kanwar YS，et al.Screening for genes upregulated in 5/6 nephrectomized mouse kidney［J］.Kidney Int，1999，56(2):549-558.

［2］Li H，Zang H，Wang HY，et al.Collectrin，a kidney-specific gene，is localized in collecting duct cells in kidney［J］.China J Mod Med，2004，14(10):12-15.

［3］Fukui K，Yang Q，Cao Y，et al.The HNF-1 target Collectrin controls insulin exocytosis by SNARE complex formation［J］.Cell Metab，2005，2(6):373-384.

［4］張宏，和田淳，李寒，等.人Collectrin同源基因的分離克隆及其在人腎集合管和遠(yuǎn)曲小管的特異表達(dá)［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2004，20(5):630-636.

［5］Turner AJ，Tipnis SR，Guy JL，et al.ACEH/ACE2 is a novel mammalian metallocarboxypeptidase and a homologue of angiotensinconverting enzyme insensitive to ACE inhibitors［J］.Can J Physiol Pharmacol，2002，80(4):346-353.

［6］Donoghue M，Hsieh F，Baronas E，et al.A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase(ACE2)converts angiotensin I to angiotensin 1-9［J］.Circ Res，2000，87(5):E1-9

［7］Tipnis SR，Hooper NM，Hyde R，et al.A human homolog of angiotensin-coveting enzyme.Cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase［J］.J Biol Chem，2000，275:33238-33243.

［8］Zhang H，Wada J，Hida K，et al.Collectrin，a collecting duct-specific transmembrane glycoprotein，is a novel homolog of ACE2 and is developmentally regulated in embryonic kidneys［J］.J Biol Chem，2001，276(20):17132-17139.

［9］McCoy KE，Zhou X，Vize PD.Collectrin/tmem27 is expressed at high levels in all segments of the developing Xenopus pronephric nephron and in the Wolffian duct［J］.Gene Expr Patterns，2008，8(4):271-274.

［10］Malakauskas SM，Quan H，F(xiàn)ields TA，et al.Aminoaciduria and altered renal expression of luminal amino acid transporters in mice lacking novel gene Collectrin［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2007，292(2):F531.

［11］Danilczyk U，Sarao R，Remy C，et al.Essential role for Collectrin in renal amino acid transport［J］.Nature，2006，444(7122):1088-1091.

［12］Vanslambrouck M，Broer A，Thavyogarajah T，et al.Renal imino acid and glycine transport system ontogeny and involvement in developmental iminoglycinuria［J］.Biochem J，2010，428(3):397-407.

［13］Singer D，Camargo SM，Huggel K，et al.Orphan transporter SLC6A18 is renal neutral amino acid transporter B0AT3［J］.J Biol Chem，2009，284(30):19953-19960.

［14］Yamagata K，Nammo T，Sato Y，et al.The HNF-1a-SNARE connection［J］.Diabetes Obes Metab，2007，9(2):40-45.

［15］Akpinar P，Kuwajima S，Krützfeldt J，et al.Tmem27:a cleaved and shed plasma membrane protein that stimulates pancreatic beta cell proliferation［J］.Cell Metab，2005，2(6):385-397.

［16］Yasuhara A，Wada J，Malakauskas SM，et al.Collectrin is involved in the development of salt-sensitive hypertension by facilitating the membrane trafficking of apical membrane proteins via interaction with soluble N-ethylmaleiamide-sensitive factor attachment protein receptor complex［J］.Circulation，2008，118(21):2146-2155.

［17］Zhang Y，Wada J，Yasuhara A，et al.The role for HNF-1β-targeted Collectrin in maintenance of primary cilia and cell polarity in collecting duct cells［J］.PLoS ONE，2007，2(5):e414.

［18］張宏，王湘玲，張艷玲，等.小鼠Collectrin正反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能［J］.北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2004，36(2):181-184.

［19］張宏，張艷玲，梁秀彬，等.應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選新基因Collectrin相關(guān)蛋白［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2005，21(2):180-184.

［20］Malakauskas SM，Kourany WM，Zhang XY，et al.Increased insulin sensitivity in mice lacking Collectrin，a downstream target of HNF-1alpha［J］.Mol Endocrinol，2009，23(6):881-892.

［21］Saisho K，F(xiàn)ukuhara A，Yasuda T，et al.Glucose enhances Collectrin protein expression in insulin-producing MIN6 beta cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，389(1):133-137.