癌基因Twist在骨肉瘤中的研究進展

蔣 棟(綜述)，肖 揚，伍旭輝(審校)

(南華大學附屬婁底市中心醫(yī)院骨科，湖南婁底417000)

Twist是進化過程中的一個保守轉錄因子，可調節(jié)胚胎發(fā)育過程中的細胞重建，并賦予細胞遷移的能力。近年來研究認為，Twist是一種凋亡抑制蛋白，也可視為一種癌基因，其過量表達可能促進細胞表型的惡性轉化，是某些惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關鍵因素，特別是與上皮-間質轉變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及惡性腫瘤生長、侵襲、轉移和細胞凋亡關系密切［1］。Twist與骨肉瘤關系密切，因此，Twist與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷及治療之間的關系也成為近年來的研究熱點。

1 Twist的發(fā)現(xiàn)、結構特征及功能

1987年，Thisse等［2］在研究果蠅胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)Twist基因，因其突變后引起果蠅胚胎扭曲樣(Twist意為扭曲)變化而得。果蠅 Twist基因序列包括5'端的重復序列“cax”，它的功能是編碼含490個氨基酸的Twist蛋白，Twist蛋白作為核蛋白出現(xiàn)于野生果蠅胚胎發(fā)育的各個時期和腦室附近及整個中胚層。后來Twist基因相繼在水母、文昌魚、斑馬魚、非洲蟾蝓、小鼠、大鼠以及人類中被確認。

Twist屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋結構的轉錄因子家族，在不同的種屬之間其核甘酸和氨基酸序列高度保守。在脊椎動物中存在兩個Twist基因:Twist1(即 Twist)和 Twist2(也稱之為demo-1)。人類Twist基因定位于7p21.2處，含有2個外顯子和1個內含子，第1個外顯子長772 bp，包含整個編碼區(qū)域，內含子長為538 bp，mRNA全長1669 bp。人Twist蛋白分子包含202個氨基酸，由N-端、堿性螺旋-環(huán)-螺旋、C-端三個區(qū)域組成，通過分子中的堿性螺旋-環(huán)-螺旋與DNA上的E-box結合，進而形成同源或異源二聚體，調節(jié)靶基因的表達［3］。正常情況下，Twist主要表達于胎盤，胚胎中胚層和成人的某些中胚層來源的未分化組織，在誘導細胞移動及組織塑形中起主要作用。Twist基因在胚胎期幼稚中胚層細胞和中胚層起源器官中表達最多，而出生后在成熟組織降至低水平。研究發(fā)現(xiàn)，Twist異常高表達可能引起腫瘤，但在一些組織器官的發(fā)育過程中，Twist表達減少也會引起不良后果，如果蠅Twist發(fā)生純合子突變會導致不能形成腹鰭溝、鐵乏中胚層和內臟［3］;人Twist基因突變可導致Saethre-Chothzen綜合征［4］，Saethre-Chothzen綜合征是以顱縫早閉最明顯的一系列肢體和顱面異常為特征的遺傳性疾病。

2 Twist在腫瘤中的作用機制

相關胚胎發(fā)育基因常與腫瘤發(fā)生密切相關。一些涉及胚胎發(fā)育的基因異常激活經常成為腫瘤發(fā)生的原因，反之，一些原癌基因常是胚胎發(fā)育的重要調節(jié)因子。在研究人類腫瘤過程中發(fā)現(xiàn)，Twist異常表達與腫瘤關系密切。目前研究發(fā)現(xiàn)，Twist在多種腫瘤中表達上調，Twist能影響腫瘤細胞凋亡、抑制分化、參與腫瘤細胞的耐藥及腫瘤的血管生成，從而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

2.1 Twist在細胞凋亡中的作用 人體中各組織細胞數目的維持是由細胞增殖與凋亡之間的平衡來實現(xiàn)的。如果細胞增殖速度加快和(或)細胞凋亡速度減慢，均可引起體內細胞異常增多，甚至導致腫瘤的發(fā)生。細胞增殖與凋亡失衡在大多數惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。最近研究認為，Twist是一種凋亡抑制蛋白，其過量表達可能促進細胞表型的惡性轉化［5］。Maestro 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，Twist具有癌基因的特征，能編碼凋亡抑制蛋白，它能阻礙Myc基因的促凋亡作用，從而抑制腫瘤細胞的凋亡。Yang等［7］認為，Twist可能在激活或抑制下由不同的靶基因(包括凋亡基因)激活抗凋亡程序，使上皮細胞發(fā)生EMT，增強細胞抗凋亡能力。Twist還可通過蛋白激酶B途徑的亞性調控作用抑制凋亡，促進腫瘤的發(fā)生。

2.2 Twist在腫瘤血管生成中的作用 腫瘤的血管生成在腫瘤的生長、轉移、復發(fā)中具有重要作用。血管的生成受促血管生成因子和抑制血管生成因子的互相調節(jié)，血管內皮生長因子(vascular endothdial growth factor，VEGF)被認為是最重要的血管生成因子之一，能夠促進血管內皮細胞生長、增殖和遷移。正常組織VEGF呈低水平、穩(wěn)定的表達，而在大多數惡性腫瘤表達增高，并能誘導腫瘤血管新生。

近年研究顯示，Twist可以促進VEGF的合成從而促進腫瘤血管生成。Hu等［8］發(fā)現(xiàn)凝血酶可以上調Twist，而Twist上調又可誘導許多血管生長因子和受體(如VEGF、促血管生成素2、基質金屬蛋白酶1等)的上調。Mironchik等［9］報道，轉染 Twist正義基因的乳腺癌MCF-7細胞系比空載體轉染的乳腺癌細胞分泌VEGF明顯增加，通過磁共振成像分析發(fā)現(xiàn)轉染Twist正義基因的腫瘤內血管體積和滲透高于對照組，直接說明了Twist能夠調控血管成相關分子的表達，從而誘導腫瘤新生血管。Niu等［10］研究顯示，肝癌組織中微血管密度在Twist表達陽性的腫瘤細胞的表達要高于Twist表達陰性的腫瘤細胞，Twist蛋白的過度表達與VEGF的表達呈正相關。

2.3 Twist在腫瘤侵襲轉移中的作用 EMT在許多腫瘤進展中起重要作用，它是一個失去上皮細胞極性、細胞與細胞接觸能力，并且重塑細胞骨架的過程，其特征是失去上皮性的標記(如E鈣黏蛋白)而獲得間質細胞的標記(如N鈣黏蛋白等)［11］，促進瘤細胞侵襲和轉移。研究表明，Twist作為EMT過程中的關鍵調控因子，對腫瘤細胞侵襲和轉移有重要作用［12］。E鈣黏蛋白介導的細胞間黏附作用的喪失是腫瘤細胞侵襲和轉移過程中的重要起始步驟。Twist能識別E鈣黏蛋白啟動子上的E-box基序，從而抑制其轉錄，E鈣黏蛋白功能或表達下調將使無侵襲力的細胞變得有侵襲能力。Yang等［13］在研究乳腺癌實驗中發(fā)現(xiàn)，Twist在腫瘤的轉移階段表達明顯增強，應用RNA干擾技術去除腫瘤高轉移細胞株Twist基因的表達后，乳腺癌細胞肺轉移的數目和速率都顯著下降。于丁等［14］報道乳腺癌干細胞通過上調Twist表達的EMT參與腫瘤轉移。Yuen等［15］在研究前列腺癌時發(fā)現(xiàn)，E鈣黏蛋白的表達缺失或紊亂與Twist在細胞質和細胞核的高表達有關，Twist通過促進EMT來加速前列腺癌的轉移，且95%的Twist陽性患者發(fā)生了繼發(fā)性骨損傷，推測Twist的高表達在前列腺癌骨轉移中發(fā)揮重要作用，可以作為前列腺癌的一個高風險預后指標。王立瑤等［16］在甲狀腺乳頭狀癌的研究中也發(fā)現(xiàn)Twist與E鈣黏蛋白的表達呈明顯負相關。

2.4 Twist在腫瘤細胞耐藥中的作用 腫瘤細胞的耐藥性是臨床上腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因，而多耐藥基因及P糖蛋白是腫瘤多耐藥性的主要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤耐藥和轉移往往同時存在，因為它們存在相同的信號通路，如編碼P糖蛋白的多藥耐藥基因的轉錄激活調節(jié)是通過促分裂素原活化蛋白激酶通路，而調節(jié)EMT發(fā)生的另一個轉錄因子Snail的轉錄激活也是促分裂素原活化蛋白激酶通路［13］，因而 Twist在促進EMT發(fā)生的同時也可以促進腫瘤細胞多耐藥的發(fā)生。

在研究肝癌多耐藥細胞系中發(fā)現(xiàn)，Twist表達明顯增加且更容易發(fā)生侵襲轉移。Wang等［17］利用比較基因組雜交分析方法，在獲得性紫杉醇抵抗的鼻咽癌細胞系HNE1-T3中發(fā)現(xiàn)Twist的上調使細胞獲得對紫杉醇的耐藥性，隨后在其他實體腫瘤中相繼發(fā)現(xiàn)同樣的耐藥結果。Cheng等［18］報道，在乳腺癌細胞株MCF-7中，Twist通過轉錄上調AKT2的表達，減少了凋亡細胞的比例，從而增加了對紫杉醇的抗性。另外，Twist也可通過調控AKT信號途徑使細胞產生對紫杉醇的耐藥性。Li等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在體內采用RNA干擾Twist-1能夠改善阿霉素對乳腺癌的療效。上述研究說明，Twist在腫瘤細胞耐藥性中發(fā)揮著重要作用。

3 Twist與骨肉瘤的關系

目前國內外對Twist在骨肉瘤中的研究報道尚不多見。Kronenberg［20］研究發(fā)現(xiàn)，Twist能通過調節(jié)成骨細胞中轉錄因子2的活力調節(jié)骨的形成和發(fā)育。成骨細胞中轉錄因子2對持續(xù)激活成人成骨細胞非常重要，而成骨細胞中轉錄因子2缺乏使骨化過程中成骨細胞不能分化，而且軟骨細胞轉化變慢。相反，Twist過高表達可致成骨細胞中轉錄因子2增加，促進成骨細胞分化，從而可能導致骨腫瘤的發(fā)生。2005年，法國學者 Entz-Werlé等［21］研究發(fā)現(xiàn)，Twist所在的染色體組變異與小兒骨肉瘤的發(fā)生關系密切。隨后研究發(fā)現(xiàn)，Twist是一種成纖維細胞生長因子，MET、Twist在參與小兒骨肉瘤形成中有重要作用［22］。

何昀等［23］篩選特異性沉默人的 Twist基因的siRNA序列，構建siTwist腺病毒并在MG63及143B骨肉瘤細胞中進行功能鑒定，結果發(fā)現(xiàn)在HEK293細胞中，四組siTwist中有兩組GFP表達明顯降低，且siTwist腺病毒能抑制143B骨肉瘤細胞中內源性的Twist表達，Twist腺病毒能促進MG63骨肉瘤細胞的增殖和轉移，而siTwist與Twist共感染組MG63細胞的增殖及遷徙率均明顯低于Twist組。成功構建腺病毒，轉染細胞后能有效抑制內源性和外源性的Twist表達，為研究Twist在骨肉瘤細胞增殖和轉移中的作用及具體機制提供了有效的分子工具。

4 展望

Twist與多種腫瘤關系密切，盡管其參與腫瘤發(fā)生、血管生成、侵襲轉移及耐藥等，但是其具體機制尚不明確。Twist能促進EMT，被認為是上皮源性腫瘤的主要機制，而在間葉源性的骨肉瘤中Twist是否有另外的作用機制尚不清楚。相信隨著科學的發(fā)展，對Twist在骨肉瘤的研究會更為深入，使以Twist基因為靶點治療骨肉瘤成為現(xiàn)實，為骨肉瘤患者縮小切除范圍、提高保肢率、增加5年生存率帶來希望。

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