上皮緊密連接與炎性腸病的研究進(jìn)展

蔡文娟（綜述），章明放（審校）

（天津市第一中心醫(yī)院病理科，天津 300192）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）又稱腸炎，是一組腸道炎癥性疾病的統(tǒng)稱。一般指大腸內(nèi)的炎癥，有時(shí)候也被用來(lái)指小腸內(nèi)的炎癥，主要包括克羅恩?。–rohn disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）。CD可影響消化系統(tǒng)的任何部分，從口腔至肛門都有可能發(fā)生跳躍性病變，多發(fā)于回腸末端。而UC發(fā)病僅限于結(jié)腸和直腸部分。黏膜上皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的各種連接結(jié)構(gòu)是腸道抵御外環(huán)境中有害物質(zhì)或病原體入侵腸黏膜組織的關(guān)鍵，是維持腸上皮的選擇通透性及其屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。腸上皮細(xì)胞頂端的緊密連接及與之相鄰的黏附連接組成了頂端連接復(fù)合體，是調(diào)控黏膜屏障的主要組成部分。其中，緊密連接是維持上皮細(xì)胞間機(jī)械屏障最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1 腸上皮緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能

緊密連接在冰凍蝕刻電鏡下表現(xiàn)為一系列交織的膜內(nèi)束，由跨膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)接頭蛋白組成，形成復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)?？缒さ鞍资蔷o密連接的主要成分，它們能夠穿透緊密連接，將鄰近細(xì)胞的胞膜連接起來(lái)，形成密封結(jié)構(gòu)。最主要的三種跨膜蛋白是occludin、claudin家族（至少包括24個(gè)成員）和連接黏附分子（junctional adhesion molecule，JAM）。緊密連接的主要作用是封閉相鄰細(xì)胞間的接縫，防止溶液中的分子沿細(xì)胞間隙滲入體內(nèi)，從而保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，其作用包括:①細(xì)胞間隙的頂端形成滲透屏障，調(diào)節(jié)水和電解質(zhì)的極向運(yùn)動(dòng)，防止大分子物質(zhì)經(jīng)腸腔漏到周圍組織中。②造成膜質(zhì)的區(qū)域性差異，使這些區(qū)域可進(jìn)行專一的功能活動(dòng)，如離子的定向轉(zhuǎn)運(yùn)和大分子吸收，阻止膜中脂類和蛋白質(zhì)的側(cè)向擴(kuò)散。③具有一定生理作用，如上皮細(xì)胞分化［1］。

2 IBD中緊密連接的破壞

輕中度CD活動(dòng)時(shí)，上皮膜電阻抗（transepithelial electrical resistance，TER）下降，緊密連接復(fù)雜程度也有下降，包括緊密連接束數(shù)目減少和不連續(xù)、緊密連接網(wǎng)絡(luò)深度下降等［2］。緊密連接的數(shù)目與TER呈對(duì)數(shù)關(guān)系，故TER是判斷緊密連接屏障功能的主要指標(biāo)。緊密連接束不連續(xù)是大分子（如食物抗原或細(xì)菌內(nèi)毒素）穿透上皮屏障的關(guān)鍵原因。Oshitani等［3］研究顯示，CD病變部位上皮膜蛋白中occludin、claudin-5和claudin-8表達(dá)均下調(diào)，而claudin-2表達(dá)卻上調(diào)，且claudin-5和claudin-8可重新分布，到達(dá)緊密連接以外部位，失去其功能。同時(shí)研究顯示［3］，CD非活動(dòng)部位的緊密連接也受到破壞，跨膜蛋白o(hù)ccludin和胞質(zhì)附著蛋白ZO家族可重新分布到細(xì)胞基底膜及固有層的細(xì)胞外基質(zhì)中。

在UC中，病變腸管上皮屏障功能可下降80%以上，緊密連接束數(shù)目及網(wǎng)絡(luò)深度也下降，但連續(xù)性卻不受影響。UC病變腸管不論多形核細(xì)胞滲出是否活躍，均有急劇、廣泛的occludin下調(diào)，其他緊密連接蛋白如ZO-1、JAM-A、claudin-1等在多形核細(xì)胞滲出活躍的部位下降，但在其他部位不受影響［4］。

3 炎性因子在緊密連接破壞中的作用

IBD中免疫反應(yīng)異常一直被認(rèn)為是發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。當(dāng)IBD發(fā)病時(shí)炎癥破壞黏膜屏障，腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)及病原菌向腸黏膜固有層移位并激活固有層免疫細(xì)胞，產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子及介質(zhì)，其炎性分子進(jìn)一步加劇黏膜屏障損傷，腸上皮細(xì)胞緊密連接破壞導(dǎo)致細(xì)胞間隙通透性增加，細(xì)菌、內(nèi)毒素及大分子物質(zhì)就可通過(guò)緊密連接進(jìn)入體循環(huán)［5］。

IBD發(fā)生時(shí)，炎性因子干擾素 γ（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）導(dǎo)致黏膜屏障破壞早有定論。

3.1 TNF與炎性腸病 眾所周知，TNF是重要的免疫介質(zhì)和促炎因子，研究認(rèn)為TNF在IBD發(fā)病過(guò)程中免疫應(yīng)答和持續(xù)具有不可缺少的作用。TNF-α可以增加腸上皮細(xì)胞旁的通透性，降低腸上皮細(xì)胞屏障的跨上皮電阻TER［6］。許多研究探討了TNF-α調(diào)節(jié)緊密連接的可能機(jī)制，TNF-α能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子活化，活化的核因子κB、p50/p65亞基與肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）基因的啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)MLCK轉(zhuǎn)錄，增加MLCK蛋白的表達(dá)［7］。Shen 等［8］發(fā)現(xiàn)，MLCK 促使肌球蛋白輕鏈磷酸化后，ZO-1和occludin及緊密連接周圍骨架蛋白F-actin將重新分布，導(dǎo)致緊密連接破壞，增加通透性，但claudin-1和claudin-2受影響有限。TNF-α不僅能直接影響上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)及分布，并能與IFN-γ呈協(xié)同作用，誘導(dǎo)MLCK等緊密連接調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。

3.2 IFN-γ與 IBD IFN-γ能夠啟動(dòng)上皮細(xì)胞對(duì)TNF-α的反應(yīng)，之后TNF-α通過(guò)上調(diào)MLCK和促使MLCK磷酸化破壞緊密連接。經(jīng)IFN-γ預(yù)處理后細(xì)胞TNFR2表達(dá)增加是TNF-α發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素，IFN-γ通過(guò)誘導(dǎo)TNFR2表達(dá)，激活腸上皮對(duì) TNF-α產(chǎn)生反應(yīng)［9］。這些研究提示，阻斷TNFR2可能作為恢復(fù)重建腸道屏障的潛在靶點(diǎn)之一，對(duì)IBD有治療作用［10］。同時(shí)研究顯示，IFN-γ絲氨酸蛋白酶抑制劑4-（2-氨乙基）苯磺酰氟鹽酸鹽能通過(guò)改善斷裂的claudin-2而使IFN-γ破壞的腸黏膜上皮屏障得以恢復(fù)［11］。在IBD發(fā)病早期，腸黏膜IFN-γ水平明顯增高，并上調(diào)MLCK等緊密連接調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，使緊密連接蛋白的表達(dá)下降，導(dǎo)致腸黏膜通透性增高［12］。

3.3 IL-13與IBD 白細(xì)胞介素（interleukin，IL）13是Th2類炎性因子。UC時(shí)主要由黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生，固有層細(xì)胞高表達(dá)IL-13。體外經(jīng)IL-13的誘導(dǎo)，腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白claudin-2的表達(dá)也平行增高，claudin-2能誘導(dǎo)腸黏膜針對(duì)小分子物質(zhì)的通透性增高，導(dǎo)致UC臨床癥狀出現(xiàn)，如腹瀉等。UC腸道claudin-2表達(dá)水平可達(dá)正常人10倍以上。因此，在UC發(fā)病中，IL-13水平增高可影響腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)及分布。IBD炎性腸黏膜高表達(dá)的其他細(xì)胞因子，如IL-1B也能影響上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)及分布。IL-1B是腸道炎性反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)環(huán)節(jié)的核心炎性因子。在生理劑量范圍內(nèi)IL-1B可引起人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞TER下降，并呈劑量和時(shí)間效應(yīng)［13］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IL-1B可使MLCK表達(dá)和活性增加，而MLCK表達(dá)增加可導(dǎo)致核因子κB活化，導(dǎo)致緊密連接破壞［14］。

腸道炎性反應(yīng)是否由緊密連接損害直接啟動(dòng)?這些損害是否是腸道過(guò)度炎性反應(yīng)和促炎因子破壞的后果?應(yīng)用基因剔除或轉(zhuǎn)基因小鼠模型，闡述緊密連接蛋白在IBD發(fā)病機(jī)制中的作用可能對(duì)解答這些疑問(wèn)有一定幫助。葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)JAM-A缺失小鼠，試驗(yàn)組疾病活動(dòng)度、便血和結(jié)腸攣縮程度均高于對(duì)照組，而體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組。JAM-A是緊密連接蛋白的組分之一，小鼠JAM-A缺失后，結(jié)腸上皮通透性增加，上皮TER下降，而黏膜下中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加，并有淋巴細(xì)胞濾泡集合趨勢(shì)，類似IBD的表現(xiàn)［15］。有研究顯示，小鼠occludin缺失后并無(wú)腸道通透性下降。這可能是因?yàn)閛ccludin剔除后，某些與之功能類似的蛋白高度表達(dá)，從而彌補(bǔ)了occludin缺乏造成的腸屏障功能障礙。

CD患者的屏障功能障礙體現(xiàn)了病變過(guò)程的早期反應(yīng)，其可能受到遺傳因素的影響，并由環(huán)境因素，如腸腔內(nèi)食物抗原或細(xì)菌所觸發(fā)。對(duì)于腸屏障功能障礙在CD中的作用機(jī)制并不十分明確，有研究顯示輕度或者暫時(shí)性的上皮緊密連接打開(kāi)有助于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生，阻止黏膜炎性反應(yīng)［16］。

4 保護(hù)腸上皮屏障藥物在IBD治療中的作用

4.1 對(duì)細(xì)胞骨架的保護(hù)和治療 n-3多不飽和脂肪酸對(duì)臨床IBD的治療價(jià)值已經(jīng)得到肯定。其作用機(jī)制除免疫調(diào)節(jié)、減輕組織炎性反應(yīng)外，還能起到保護(hù)上皮緊密連接的作用。n-3多不飽和脂肪酸能夠降低IFN-γ和TNF-α誘導(dǎo)的體外上皮細(xì)胞TER下降、緊密連接形態(tài)破壞、以及occludin和ZO-1的再分布等。大鼠腸炎模型經(jīng)n-3多不飽和脂肪酸處理后，緊密連接蛋白ZO-1、claudin-1、claudin-5和claudin-8的表達(dá)水平明顯增加，超微結(jié)構(gòu)也明顯好轉(zhuǎn)［17］。

4.2 腸上皮的修復(fù) 三葉肽可以促進(jìn)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子對(duì)上皮的修復(fù)作用，在潰瘍附近修復(fù)腸上皮［18］。谷氨酰胺是腸上皮細(xì)胞所特需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，體外Caco-2細(xì)胞，如剝奪谷氨酰胺、細(xì)胞occludin、claudin-1和ZO-1表達(dá)水平均下降，分布亦受影響，緊密連接復(fù)合體的數(shù)目、致密程度和復(fù)雜程度同時(shí)受到影響。實(shí)驗(yàn)顯示，乙醛處理Caco-2細(xì)胞后，細(xì)胞旁通透性增加，occludin、ZO-1均重新分布，而給予L-谷氨酰胺則可逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程［19］。上皮特異性的生長(zhǎng)因子也具有維護(hù)上皮緊密連接的作用。表皮生長(zhǎng)因子能迅速降低壞死性小腸炎小鼠腸上皮通透性，使occludin和claudin-3表達(dá)水平恢復(fù)正常［20］。

4.3 對(duì)于緊密連接的修復(fù)和治療 過(guò)度表達(dá)的TNFR-2介導(dǎo)TNF信號(hào)通路，觸發(fā)上皮增加MLCK的表達(dá)及MLCK磷酸化，細(xì)胞緊密連接蛋白損傷和屏障功能喪失。這為修復(fù)腸屏障功能、阻止疾病發(fā)展過(guò)程中提供了一個(gè)新的途徑［21］。

依那西普是重組的可溶性人TNFR蛋白，可競(jìng)爭(zhēng)性地與s-TNF-α結(jié)合，阻斷TNF-α與受體結(jié)合，降低TNF-α活性，干擾信號(hào)通路，從而達(dá)到治療效果。雖然在IBD治療中效果不確切，但從理論上這也為治療IBD提供了新的思路［21］。

4.4 其他治療方法 益生菌已被長(zhǎng)期用于IBD的臨床治療?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制亦與調(diào)節(jié)上皮緊密連接有關(guān)。體外研究顯示，益生菌 E.coli Nissle 1917（EcN）能夠調(diào)節(jié)蛋白激酶C信號(hào)途徑，并使緊密連接蛋白ZO-2表達(dá)增加和重新分布，逆轉(zhuǎn)致病菌引起的腸上皮細(xì)胞緊密連接破壞［22］。

另外，目前開(kāi)發(fā)的中草藥和一些中成藥對(duì)腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞間緊密連接也具有一定的保護(hù)作用，而且不良反應(yīng)相對(duì)較小。小檗堿（黃連素）是我國(guó)傳統(tǒng)中藥黃連的主要成分，臨床上對(duì)各種微生物所致腸炎均有一定的療效，同時(shí)小檗堿對(duì)腸黏膜屏障及緊密連接的功能可能也具有保護(hù)作用［23］。

5 小結(jié)

腸黏膜屏障有效地將腸腔內(nèi)的抗原、細(xì)菌等有害物質(zhì)與腸固有層的免疫組織相隔絕，避免激活腸固有層的免疫組織反應(yīng)。這其中以腸上皮的緊密連接最為重要。IBD發(fā)病時(shí)，原發(fā)損害和繼發(fā)損傷都破壞腸上皮間連接，有害物質(zhì)侵入固有層，繼發(fā)過(guò)度免疫反應(yīng)。目前，除開(kāi)發(fā)的中藥以外，許多特異性的生長(zhǎng)因子及激酶抑制劑可以有效減輕炎性反應(yīng)，同時(shí)保護(hù)上皮連接，改善黏膜屏障，這些都將是IBD治療的新目標(biāo)。

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