血清microRNA的檢測(cè)及臨床應(yīng)用進(jìn)展

孫 偉(綜述)，史冬泉，蔣 青(審校)

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院關(guān)節(jié)中心，南京210008)

microRNA(miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種能調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小分子RNA，參與生物體的正常生長(zhǎng)發(fā)育及腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝炎等疾病狀態(tài)過(guò)程。檢測(cè)血清miRNA表達(dá)譜對(duì)疾病的診斷、療效判定及預(yù)后評(píng)估等方面有重要的臨床意義。血清miRNA主要的檢測(cè)方法有克隆測(cè)序、RNA印跡雜交、基因芯片、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcrip-tion polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)。目前，該項(xiàng)檢測(cè)已在實(shí)驗(yàn)室及臨床得到較廣泛應(yīng)用。

1 miRNA形成

miRNA是一組單鏈的、非編碼的長(zhǎng)度為21～25個(gè)單位的miRNA，在生物進(jìn)化和疾病發(fā)展過(guò)程中起著調(diào)控作用。大量的mRNA被認(rèn)為是miRNAs的靶向目標(biāo)，并且一種 miRNA 可以靶向多種 mRNA［1，2］。miRNA在動(dòng)物體內(nèi)的形成過(guò)程大致如下:細(xì)胞核內(nèi)編碼miRNA的基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成初級(jí)轉(zhuǎn)錄物 pri-miRNA［3］，pri-miRNA 在一種RNaseⅢ核酸酶作用下剪切miRNA前體pre-miRNA［4］。pre-miRNA在Dicer酶的作用下轉(zhuǎn)化為成熟的miRNA。miRNA與靶信使RNA(mRNA)3'非翻譯區(qū)(UTR)特異性地結(jié)合從而使其降解或者抑制其翻譯［5］，進(jìn)一步來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。miRNA參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、細(xì)胞分化、神經(jīng)分化、病毒感染機(jī)制及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面［6］。

2 血清miRNA的特點(diǎn)及檢測(cè)

RNA分子易于降解，這在一定程度上限制了體液中RNA分子作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用。但是前一階段的大量研究表明，血清中存在著穩(wěn)定miRNA［7-10］，血清miRNA在室溫、高溫、不同pH、多次凍融后仍能檢測(cè)到，并且含量變化不大［7］，而此時(shí)大多數(shù)RNA都會(huì)降解。這就為血清miRNA作為生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)提供了可能。對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的miRNA分子，克隆測(cè)序仍是首選方法［11，12］。RNA 印跡雜交，主要包括Northern雜交和原位雜交，是驗(yàn)證和確認(rèn)miRNA的重要方法，但該方法繁瑣并且靈敏度較低，不適用于臨床樣本的高通量檢測(cè)［13］。芯片技術(shù)檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)快速、高通量檢測(cè)［14］。目前已有多種類(lèi)型的miRNA檢測(cè)芯片可以選用。但是，基因芯片檢測(cè)方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性比較差，過(guò)去一般多用于初篩，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到第二代基因芯片技術(shù)，即Solexa測(cè)序，研究人員可通過(guò)其大量的平行測(cè)序，發(fā)掘、鑒定并定量出任何物種全基因組水平的miRNA圖譜。應(yīng)用這種低成本快速測(cè)定數(shù)百萬(wàn)標(biāo)簽序列的新方法，對(duì)獲得的結(jié)果通常需要采用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證［7，15］。RT-PCR方法是基于PCR原理的檢測(cè)方法，主要包括基于莖-環(huán)的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)、基于polyA 加尾的 RT-PCR 方法［16，17］和實(shí)時(shí)定量或非半定量RT-PCR。使用RT-PCR方法檢測(cè)血清miRNA所獲得純度高，方法也較為簡(jiǎn)便，是現(xiàn)在測(cè)定血清miRNA的常用方法。

3 血清miRNA在疾病診治中的應(yīng)用

3．1 血清內(nèi)miRNA與腫瘤 腫瘤領(lǐng)域是血清miRNA研究最早、涉及病種最多的研究領(lǐng)域，涉及的腫瘤包括全身各個(gè)系統(tǒng)。一種miRNA可以調(diào)控多個(gè)下游的數(shù)百個(gè)基因，因此，通過(guò)miRNA獲得的信息比蛋白編碼基因更能對(duì)癌癥的亞型進(jìn)行分類(lèi)［18，19］。通過(guò)分析腫瘤患者與正常對(duì)照者血清miRNA表達(dá)的差異，有可能篩選到特異性好、靈敏度高、可作為特定腫瘤分子標(biāo)志物的miRNA。在某些腫瘤患者血清中上調(diào)表達(dá)的miRNA，在另一些腫瘤中可能表達(dá)下調(diào)，提示血清miRNA在不同條件下可行使癌基因或抑癌基因的功能。Mitchell等［20］的研究證明，轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者血清中miR-141含量是健康男性對(duì)照組的46倍，可成為檢測(cè)前列腺癌的血清miRNA標(biāo)志物。Resnick等［10］通過(guò)研究患有卵巢癌婦女與正常婦女血清中的miRNA和CA125發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-92、miR-93在患者組的表達(dá)水平明顯增高，患者組中有3例未經(jīng)手術(shù)的患者CA125正常，但其 miR-21、miR-92、miR-93仍然顯著增高。Hu等［15］最新研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌長(zhǎng)期生存患者與短期生存患者血清miRNA表達(dá)差異。用Solexa法選取在兩組患者血清中都表達(dá)的且表達(dá)差異＞5倍的11種miRNA進(jìn)行樣本血清qRT-PCR驗(yàn)證，最后得到5種具有顯著差異的 miRNA，其中 miR-486、miR-30d、miR-1、miR-499可作為非小細(xì)胞肺癌的生存預(yù)期的生物標(biāo)志物。

3．2 血清內(nèi)miRNA與肝病 肝臟中含有大量的miRNA-122，Bihrer等［21］從患有慢性丙型肝炎的患者和正常人中分別抽取血清進(jìn)行miR-122檢查，同時(shí)對(duì)患者組進(jìn)行肝功能組織學(xué)檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者血清中miR-122水平明顯高于正常對(duì)照組，并且miR-122水平與肝臟炎癥程度指標(biāo)具有相關(guān)性，miR-122與肝臟的谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平和肝臟壞死性的炎癥強(qiáng)度相關(guān)，但與肝功能和肝纖維化程度無(wú)明顯相關(guān)性。因此，血清miR-122可作為慢性丙型肝炎壞死性炎癥的生物標(biāo)志物。還有研究小組研究了乙型肝炎患者以及乙肝病毒陽(yáng)性的肝癌患者血清中 miRNA，Li等［22］選取正常對(duì)照組 210 例，乙型肝炎患者135例，丙型肝炎患者48例，乙型肝炎病毒陽(yáng)性的肝癌患者120例。取乙型肝炎患者與乙型肝炎病毒陽(yáng)性肝癌患者血清miRNA分別與對(duì)照組使用Solexa測(cè)序及qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果分別發(fā)現(xiàn)13個(gè)和3個(gè)有明顯差異的 miRNA，這 13個(gè)血清 miRNA(miR-375、miR-92a、miR-10a、miR-223、miR-423、miR-23b、miR-23a、miR-342-3p、miR-99a、miR-122a、miR-125b、miR-150、let-7c)可以作為乙型肝炎的生物標(biāo)志物，3種可以作為乙型肝炎病毒陽(yáng)性肝癌標(biāo)志物的 miRNA(miR-375、miR-25 和 let-7f)。

3．3 血清內(nèi)miRNA與系統(tǒng)性紅斑狼瘡 之前已經(jīng)有較多文獻(xiàn)報(bào)道組織miRNA與免疫系統(tǒng)疾病相關(guān)。Wang等［23］研究了系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與正常對(duì)照組的血清miRNA發(fā)現(xiàn)，miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429、miR-205 和 miR-192 在患者血清中表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，其中后5個(gè)與腎小球?yàn)V過(guò)率相關(guān)，miR-200a、miR-200c與蛋白尿呈負(fù)相關(guān)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情程度與miR-200a呈負(fù)相關(guān)，血清miR-200b、miR-192與血小板計(jì)數(shù)相關(guān)，miR-205與紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血細(xì)胞比容相關(guān)。

3．4 血清內(nèi)miRNA與其他疾病 血清中miRNA作為生物標(biāo)志的研究不僅局限于以上領(lǐng)域，也在其他疾病的診治應(yīng)用中取得了進(jìn)展。Kong等［24］發(fā)現(xiàn)，在新診斷的2型糖尿病患者中，有7種血清miRNA水平明顯增高，即 miR-9、miR-29a、miR-30d，miR-34a、miR-124a、miR-146a 和 miR-375。Gilad 等［8］選取10個(gè)妊娠早期的母體血清和10個(gè)妊娠末3個(gè)月的母體血清，以及10個(gè)年齡與前兩組相匹配的非懷孕女性血清，檢測(cè)血清中包括胎盤(pán)特異性miRNA［25］在內(nèi)的28種 miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)懷孕婦女與未懷孕婦女的血清miRNA水平明顯不相同。所有胎盤(pán)miRNA在孕期血清中高表達(dá)，表達(dá)水平隨妊娠周數(shù)增加而升高，其中有12個(gè)miRNA增加超過(guò)了5倍。并且發(fā)現(xiàn)miR-526a、miR-527在妊娠末期明顯增加(超過(guò) 600倍)。胎盤(pán)中 miR-526a、miR-527和miR-520d-5P的表達(dá)水平可準(zhǔn)確用于診斷是否妊娠。

4 展望

血清miRNA研究已經(jīng)成為世界生命技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并且這種趨勢(shì)還會(huì)延續(xù)下去。隨著對(duì)miRNA作用機(jī)制的進(jìn)一步研究，將會(huì)使人們對(duì)高等真核生物基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)理解提高到一個(gè)新的水平。而與此同時(shí)，通過(guò)利用各種最新的技術(shù)手段對(duì)血清miRNA和疾病間的關(guān)系進(jìn)行研究也將使miRNA可能成為疾病診治的新的生物學(xué)標(biāo)志物，還可能使得這一分子成為藥靶，或是模擬這一分子進(jìn)行新藥研發(fā)，這可能會(huì)給人類(lèi)疾病的治療提供一種新的手段。目前對(duì)于miRNA的了解還處于初始水平，只有很小部分miRNA生物學(xué)功能得到闡明，而對(duì)于絕大多數(shù)的miRNA的生物學(xué)機(jī)制和功能知之甚少，這些都是需要進(jìn)一步研究和探索的。

［1］ Krek A，Grun D，Poy MN，et al．Combinatorial microRNA target predictions［J］．Nat Genet，2005，37(5):495-500．

［2］ Lall S，Grun D，Krek A，et al．A genome-wide map of conserved microRNA targets in C．elegans［J］．Curr Biol，2006，16(5):460-471．

［3］ Lee Y，Kim M，Han J，et al．MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerise Ⅱ［J］．EMBO J，2004，23(20):4051-4060．

［4］ Lee Y，Ahn C，Han J，et al．The nuclear RNase Ⅲ Drosha initiates microRNA processing［J］．Nature，2003，425(6956):415-419．

［5］ Szczyrba J，L?prich E，Wach S，et al．The microRNA profile of prostate carcinoma obtained by deep sequencing［J］．Mol Cancer Res，2010，8(4):529-538．

［6］ Bartel DP．MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］．Cell，2004，116(2):281-297．

［7］ Chen X，Ba Y，Ma L，et al．Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other Diseases［J］．Cell Res，2008，18(10):997-1006．

［8］ Gilad S，Meiri E，Yogev Y，et al．Serum microRNAs are promising novel biomarkers［J］．PLoS One，2008，3(9):e3148．

［9］ Shih KK，Levine DA．Exosomal microRNAs step into the biomarker arena［J］．Gynecol Oncol，2008，110(1):13-21．

［10］ Resnick KE，Alder H，Hagan JP，et al．The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform［J］．Gynecol Oncol，2009，112(1):55-59．

［11］ Hafner M，Landgraf P，Ludwig J，et al．Identification of microRNAs and other small regulatory RNAs using cDNA library sequencing［J］．Methods，2008，44(1):3-12．

［12］ Fu H，Tie Y，Xu C，et al．Identification of human fetal liver miRNAs by a novel method［J］．FEBS Lett，2005，579(17):3849-3854．

［13］ Pall GS，Hamilton AJ．Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA［J］．Nat Protoc，2008，3(6):1077-1084．

［14］ Liu CG，Calin GA，Meloon B，et al．An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tis-sues［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101(26):9740-9744．

［15］ Hu Z，Chen X，Zhao Y，et al．Serum microRNA signatures identified in a genome-wide serum microRNA expression profiling predict survival of non-small-cell lung cancer［J］．J Clin Oncol，2010，28(10):1721-1726．

［16］ Chen C，Ridzon DA，Broomer AJ，et al．Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR［J］．Nucleic Acids Res，2005，33(20):e179．

［17］ Fu HJ，Zhu J，Yang M，et al．A novel method to monitor the expression of microRNAs［J］．Mol Biotechnol，2006，32(3):197-204．

［18］ Calin GA，Croce CM．MicroRNA signatures in human cancers［J］．Nat Rev Cancer，2006，6(11):857-866．

［19］ Lu J，Getz G，Miska EA，et al．MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］．Nature，2005，435(7043):834-838．

［20］ Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al．Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(30):10513-10518．

［21］ Bihrer V，F(xiàn)riedrich-Rust M，Kronenberger B，et al．Serum miR-122 as a biomarker of necroinflammation in patients with chronic hepatitis C virus infection［J］．Am J Gastroenterol，2011，106(9):1663-1669．

［22］ Li LM，Hu ZB，Zhou ZX，et al．Serum microRNA profiles serve as novel biomarkers for HBV infection and diagnosis of HBV-positive hepatocarcinoma［J］．Cancer Res，2010，70(23):9798-9807．

［23］ Wang G，Tam LS，Li EK，et al．Serum and urinary free microRNA level in patients with systemic lupus erythematosus［J］．Lupus，2011，20(5):493-500．

［24］ Kong L，Zhu J，Han W，et al．Significance of serum microRNAs in pre-diabetes and newly diagnosed type 2 diabetes:a clinical study［J］．Acta Diabetol，2011，48(1):61-69．

［25］ Bentwich I，Avniel A，Karov Y，et al．Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs［J］．Nat Genet，2005，37(7):766-770．