Smads與器官纖維化關(guān)系的研究進展

楊 絮（綜述），張勇剛（審校）

（汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東汕頭 515041）

器官纖維化是指某器官由于局部缺血、化學物理因素、免疫反應、感染等慢性損傷，導致細胞外基質(zhì)合成與降解失調(diào)、基質(zhì)過量沉積的過程。器官纖維化的病理生理機制尚未闡明，Smads信號分子的激活在器官纖維化過程中發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)就Smads蛋白與器官纖維化疾病的研究進展予以綜述。

1 Smads蛋白家族的組成及其信號轉(zhuǎn)導

Smads蛋白家族由轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）超家族成員內(nèi)具有信號轉(zhuǎn)導功能的多種轉(zhuǎn)錄因子組成，屬于TGF超家族的亞家族，其命名源于最初發(fā)現(xiàn)的兩種蛋白，即Drosophilamothers againstdpp（Mad）和 C．elegans Sma 的融合［1］。到目前為止，哺乳動物Smads蛋白家族已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了8個成員，根據(jù)在信號傳遞過程中的作用，分為三大類:① 受體激活性 Smads（receptor-activated Smads，R-Smads），包括 Smad1、2、3、5、8，主要存在于細胞質(zhì)中，激活后可進入細胞核。其中Smad1、5、8主要由骨形成蛋白激活，而Smad2、3主要由TGF-β、激活素激活。② 通用性 Smad（common mediator Smads，Co-Smads），即 Smad4，為 R-Smads的伴侶，分布于細胞質(zhì)和細胞核。Smad4與R-Smads結(jié)合形成異二聚體，介導R-Smads核轉(zhuǎn)位。③ 抑制性Smads包括，Smad6和Smad7，是信號轉(zhuǎn)導的負反饋調(diào)節(jié)分子，主要分布于細胞核中。

Smads蛋白相對分子質(zhì)量為（42～60）×103，由三個部分組成:①MH1區(qū)，即高度保守的氨基端，約130個氨基酸，是信號轉(zhuǎn)導的抑制性結(jié)構(gòu)域。②MH2區(qū)，即高度保守的羧基端區(qū)，約200個氨基酸，主要與Smads蛋白二聚體的形成及核轉(zhuǎn)運相關(guān)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，MH2區(qū)被MH1區(qū)抑制，使Smads蛋白處于非活化狀態(tài)。③L區(qū)，即MH1和MH2之間鏈接區(qū)，與Smads蛋白同聚體的形成有關(guān)，其長度和序列多變。當受到外界信號（如TGF-β、AngⅡ、AGEs等）刺激時，R-Smads MH2區(qū)中的受體磷酸化位點（SsxS模序，即set-set-x-ser序列）激活，絲氨酸發(fā)生磷酸化，即解除MH1區(qū)的抑制作用，此過程即為R-Smads的激活?；罨蟮腞-Smads構(gòu)型改變，迅速與Smads錨著蛋白分離，而與Co-Smads結(jié)合形成異二聚體進入細胞核內(nèi)。在核內(nèi)，Smad3和Smad4可與DNA核苷酸序列上的Smads結(jié)合元件（即5'-GTCTA GAC-3'）特異性結(jié)合，Smad2由于MH1結(jié)構(gòu)域被修飾，不能與Smads結(jié)合元件結(jié)合，而與Smad4共同結(jié)合至DNA復合體中。Smads蛋白可以通過與轉(zhuǎn)錄共激活因子共同作用，促進基因的表達，還可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄共抑制因子，下調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄。在此過程中，還需要其他轉(zhuǎn)錄因子（如轉(zhuǎn)化生長影響因子、造血細胞分化調(diào)控基因、Smads核轉(zhuǎn)錄共抑制因子等）輔助參與。細胞質(zhì)中Smads蛋白的降解可以通過核小體和泛素蛋白酶途徑進行。

一系列研究表明，Smads蛋白是參與細胞的生長、增殖、凋亡、形態(tài)發(fā)生、免疫反應等過程中的重要信號分子，參與了多種器官纖維化過程，如心肌纖維化［2］、腎纖維化［3］、血管纖維化［4］等。

2 Smads與器官纖維化的關(guān)系

實質(zhì)器官纖維化的發(fā)生過程可概括為三個步驟:①損傷后上皮細胞大量產(chǎn)生、釋放并激活細胞因子（如白細胞介素6、白細胞趨化蛋白1等）使炎性細胞向原始損傷部位募集;②炎性浸潤細胞進一步分泌細胞因子，損傷上皮實質(zhì)器官，并且刺激成纖維細胞增殖，產(chǎn)生基質(zhì)蛋白;③當原始傷害刺激因素和炎癥減退后，損傷部位的生物合成反應（細胞外基質(zhì)合成）的自我激活和持續(xù)是纖維化形成的關(guān)鍵［5］。

2．1 Smads與心肌纖維化 心臟主要用由心肌細胞和心肌間質(zhì)組成。心肌間質(zhì)包括非心肌細胞（主要是成纖維細胞）和細胞外基質(zhì)，后者85%由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成，由心肌成纖維細胞合成和分泌［6］。心肌纖維化指心肌組織中膠原纖維過量沉積，各型膠原比例失調(diào)、排列紊亂，是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一，為各種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變。心肌成纖維細胞大量增殖、合成膠原是心肌纖維化進展的重要特征，多種活性因子能夠激活心肌成纖維細胞，促進心肌纖維化的發(fā)展，其中最主要有腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、TGF-β1，其他活性因子包括內(nèi)皮素、尾加壓素Ⅱ、肝細胞生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、血小板衍化生長因子等。然而，這些活性因子促進心肌纖維化的機制仍未完全闡明，而Smads信號分子的作用受到廣泛的關(guān)注。

有報道［7］，在心肌梗死后，TGF-β、Activin 等表達水平升高，同時伴有Smad2、3、4的激活。在高膽固醇飲食誘導心肌纖維化模型中，TGF-β表達上調(diào)，其下游信號Smads蛋白相應增加，同時膠原合成增多，ColⅠ/Ⅲ增加，凋亡細胞增多，心肌出現(xiàn)典型纖維化特征。體外研究發(fā)現(xiàn)［8］，TGF-β 介導的 Smads蛋白的磷酸化可以誘導心臟造血干細胞向成纖維細胞分化，而心臟造血干細胞是自身免疫性心肌炎中TGF-β誘導心肌纖維化的主要靶點。另外，小鼠主動脈縮窄術(shù)后，TGF-β 上調(diào)［9］，從而激活 Smad2/3和Smad1/5信號，誘導基質(zhì)蛋白產(chǎn)生。這都提示了TGF-β/Smad信號通路的激活在心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用。最近報道［10］，可溶性TGFβⅢ型受體可以抵抗 TGF-β誘導的 Smad2/3的活化，阻斷Smads信號轉(zhuǎn)導通路，抑制肌成纖維細胞分化，抑制心肌纖維化。

AngⅡ也可通過激活Smads信號途徑促進心肌纖維化的過程。AngⅡ能夠刺激p-Smad2/3和Smad4的表達，還能夠誘導TGF-β產(chǎn)生、協(xié)同TGF-β作用，促進纖維化發(fā)展，該效應可以被AngⅡ1型受體阻斷劑氯沙坦抑制，提示Smads激活是AngⅡ介導心肌纖維化的重要機制之一。在Smad3野生型和基因剔除型小鼠上，AngⅡ能誘導血壓升高［11］，Smad3野生型組同時伴有 TGF-β、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、ColⅠ/Ⅲ、α 平滑肌肌動蛋白表達上調(diào)，然而，Smad3基因剔除型組并無此變化。提示Smad3在心肌纖維化和心肌重塑中起關(guān)鍵作用。與此同時，在p-Smad2/3表達升高的同時，伴隨著核因子κB/p65表達增高，提示核因子κB/p65可能是Smads信通路介導纖維化過程的一個重要的中介分子。

此外，Smads信號通路在糜酶［12］、雷帕霉素靶蛋白［13］和心肌細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導［14］中也發(fā)揮了重要的作用，參與糜酶、雷帕霉素靶蛋白和心肌細胞凋亡、心肌纖維化。

但是，近來有研究提示，Smads信號通路在心肌纖維化中扮演了另外一種角色。Divakaran等［15］采用Smad3－/－小鼠制作主動脈縮窄后左心室壓力超荷模型，發(fā)現(xiàn)小鼠死亡率顯著提高，認為可能與Smad3缺失引起的惡性心律失常有關(guān)，但具體機制尚不清楚。同時還發(fā)現(xiàn)，Smad3－/－小鼠主動脈縮窄后心重指數(shù)（心重/體質(zhì)量比）、左心室厚度以及肌細胞橫斷面積均明顯上升，出現(xiàn)向心性肥大。提示Smad3可能在限定心肌細胞肥大中發(fā)揮了重要作用。國內(nèi)學者也發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能夠誘導心肌成纖維細胞上Smad7合成增加。Smad7是一個心臟的保護因子，基因上含有與Smad3～Smad4結(jié)合的序列，可因R-Smads激活后數(shù)小時內(nèi)被誘導產(chǎn)生，從而抑制Smad2/3磷酸化，通過負反饋機制抑制心肌纖維化。對于AngⅡ誘導心肌成纖維細胞上Smad7的產(chǎn)生可能是一種代償性升高。這可能為研究Smads蛋白在促進或者逆轉(zhuǎn)心肌纖維化中的信號機制提供一種新的啟示。

2．2 Smads信號通路與腎間質(zhì)纖維化 腎間質(zhì)纖維化的機制相當復雜，其中腎臟細胞外基質(zhì)生成細胞（包括腎間質(zhì)成纖維細胞、腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞）發(fā)揮著重要作用。在氧自由基、細胞因子等損害因素刺激下，這些細胞發(fā)生增殖，合成大量細胞外基質(zhì)，堆積于腎間質(zhì)，導致腎小球硬化和間質(zhì)纖維化，是各種腎臟疾病發(fā)展到腎衰竭的共同通路和病理基礎(chǔ)［16］。許多證據(jù)表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial tomesenchymal transition，EMT）是腎纖維化的一個關(guān)鍵的機制［4］。與EMT相關(guān)的信號機制主要有TGFβ/Smads，整合素/整合素連接激酶和 Wnt/βcatenin信號通路［16］。其中，TGF-β 是目前認為的最強的促腎纖維化因子，而Smads蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的TGF-β主要作用底物，能夠把TGF-β信號從細胞外傳遞到細胞核。很多EMT相關(guān)基因（如CTGF、整合素連接激酶、β1整合素、Wnt、Snail、Id1、α 平滑肌肌動蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶 2［4］）是 TGF-β/Smads 信號的作用靶點。

Sebe等［17］發(fā)現(xiàn)TGF-β促進豬的近曲小管上皮細胞上Smad2和Smad3蛋白磷酸化水平上調(diào)。其他學者發(fā)現(xiàn)［18］，Wistar大鼠體內(nèi)注射 AngⅡ 24 h后Smad3蛋白磷酸化水平明顯升高，該作用可持續(xù)至2周。在體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞上［19］，AngⅡ分別刺激15 min和24 h，發(fā)現(xiàn)Smad2/3蛋白磷酸化水平明顯上調(diào)，早期（15 min）通過AngⅡ1型受體-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/p38-Smads信號通路，而遲發(fā)相通過（24 h）AngⅡ1型受體-TGF-β-Smads信號途徑來實現(xiàn)。Smad2/3活化后，又進一步激活下游的CTGF、ColⅠmRNA和蛋白表達。Smads激活進入細胞核后，與Snail和EMT轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子1等結(jié)合，調(diào)節(jié)其下游EMT相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄［1］，如促進間質(zhì)細胞和肌成纖維細胞標志物α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白表達上調(diào)，而內(nèi)皮細胞標志物上皮鈣黏蛋白表達明顯減少［17，18］，提示 Smads 介導了 AngⅡ誘導的 EMT過程。有學者分別對Smad2和Smad3進行RNA干擾，發(fā)現(xiàn)干擾Smad3 RNA表達后可以抑制AngⅡ誘導的CTGF和ColⅠ的表達［19］。另外，體內(nèi)外實驗都發(fā)現(xiàn)［4，17］，Smad3 基因缺失可以抑制 EMT 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，抵抗EMT，減輕腎纖維化，提示Smad3在介導腎臟EMT和腎纖維化中起關(guān)鍵作用。

與Smad2/3相反，Smad7可以抑制EMT、抵抗腎纖維化。細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染Smad7可以拮抗Smad2/3的磷酸化，抑制其下游 CTGF和ColⅠ的表達［19］，并能抑制TGF-β誘導的α平滑肌肌動蛋白的表達［17］、抑制EMT。在腎臟疾病中，Smads的激活不僅與TGF-β上調(diào)有關(guān)，還與Smads的降解和調(diào)節(jié)因子有關(guān)［4］。

2．3 Smads與血管纖維化 血管纖維化表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)異常增多，過度沉積和基質(zhì)重塑，導致血管管徑縮小和（或）管壁增厚，是高血壓、糖尿病等的主要并發(fā)癥。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、內(nèi)皮素、尾加壓素Ⅱ、TGF-β、CTGF、白細胞趨化蛋白1和血小板源生長因子等的激活與血管纖維化密切相關(guān)。另外，血管纖維化也與干擾素 γ、成纖維細胞生長因子2、一氧化氮以及基質(zhì)金屬蛋白酶等抑制和降解基質(zhì)合成的因子失調(diào)有關(guān)。

Smads信號分子的激活在血管纖維化發(fā)生過程中亦發(fā)揮關(guān)鍵作用。有報道［20］，在高血壓動脈硬化患者腎動脈膠原沉積和纖維發(fā)展過程中，TGF-β通過激活Smads可以上調(diào)細胞外基質(zhì)相關(guān)基因（如前膠原、纖連蛋白、CTGF）表達。此外，體內(nèi)和體外實驗均發(fā)現(xiàn)［21］，AngⅡ能夠激活大鼠主動脈 Smad2/4，促進p-Smad2核轉(zhuǎn)位，增強其下游CTGF啟動子活性，升高基因蛋白水平。該效應可以被氯沙坦和p38促分裂原活化蛋白激酶抑制劑SB203580部分阻斷。轉(zhuǎn)染Smad7可以阻斷TGF-β誘導的纖連蛋白、膠原和CTGF的表達。有研究證實AngⅡ可通過TGF-β依賴性和非依賴性途徑激活血管平滑肌細胞中Smads信號通路，參與血管纖維化［5］。此外，AGEs能夠激活 Smad2/3［22］，增加膠原合成，即使在 TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ突變細胞中也存在上述現(xiàn)象，該效應可被細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/p38促分裂原活化蛋白激酶抑制劑阻斷，提示糖基化終末產(chǎn)物能夠直接刺激Smads，并且促分裂原活化蛋白激酶和Smads之間的串話可能在糖尿病血管病變中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

另外，Smads信號在血管外膜細胞參與血管纖維化過程中也發(fā)揮了重要作用。有報道TGF-β1能夠激活血管外膜成纖維細胞上Smads信號分子，并與促分裂原活化蛋白激酶以及整合素信號分子之間具有串話效應［23］。也有研究發(fā)現(xiàn)，過表達Smad7可減弱血管球囊擴張術(shù)后血管外膜細胞的遷移和膠原沉積，從而減輕血管纖維化［24］。

由此可見，Smads信號在血管纖維化中擔當著重要的角色。但在此過程中，Smad2和Smad3可能發(fā)揮了不同的作用。有報道Smad3缺失的血管平滑肌細胞中［5］，AngⅡ介導的血管纖維化作用消失，而Smad2缺失并無此效應。也有發(fā)現(xiàn)異位表達的Smad3可以協(xié)同TGF-β誘導纖連蛋白表達［25］，提示Smad3在血管纖維化中起了關(guān)鍵的作用。

3 結(jié)語

Smads信號與器官纖維化有著密切的關(guān)系。Smads不同亞型在促器官纖維化過程中擔當著不同的角色。以Smad 2、Smad 3為代表的R-Smads是纖維化疾病的正調(diào)控因子，以Smad 7為代表的I-Smads是纖維化疾病的負調(diào)控因子。靶向阻斷Smad 2、Smad 3蛋白的磷酸化或提高Smad 7表達以阻斷TGF-β、AngⅡ、AGEs等信號轉(zhuǎn)導通路，有望為器官纖維化疾病的臨床治療提供一種新的途徑。

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