量子點(diǎn)在生物大分子檢測中的研究進(jìn)展

李志剛(綜述)，楊 凱(審校)

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，重慶400016)

半導(dǎo)體量子點(diǎn)(semiconductor quantum dots，QDs)或稱為半導(dǎo)體納米微晶體，是一種由Ⅱ～Ⅵ族元素(如硒化鎘、硫化鎘等)或Ⅲ～Ⅴ族元素(如磷化銦、砷化銦)組成的尺寸＜100 nm的半導(dǎo)體納米晶體。1998年，Chan等［1］通過在量子點(diǎn)表面上連接巰基乙酸從而改變了量子點(diǎn)的生物相容性。Bruchez等［2］通過在量子點(diǎn)表面包上二氧化硅再連上羥基解決了量子點(diǎn)的水溶性問題，從而為量子點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用提供了可能。在過去的10多年中，人們將量子點(diǎn)用于檢測體內(nèi)外生物分子的標(biāo)志物、細(xì)胞和藥物的示蹤劑等研究，證明量子點(diǎn)是最具有發(fā)展前景和理想的生物檢測熒光探針之一［3-5］。生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子質(zhì)量達(dá)到上萬或更多的有機(jī)分子，常見的生物大分子有蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類等，對其研究具有重大意義?，F(xiàn)總結(jié)近年來量子點(diǎn)在生物大分子研究方面的應(yīng)用進(jìn)展。

1 量子點(diǎn)在生物大分子定位和功能方面的應(yīng)用

近年來人們用量子點(diǎn)對生物大分子定位和功能進(jìn)行研究。Bae等［6］將Ni-NTA(His標(biāo)簽蛋白純化試劑)與QDs連接制備Ni-NTA-QDs探針，用于對人骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)組氨酸標(biāo)記的融合蛋白的定位檢測，證明了Ni-NTA-QDs特異性定位于組氨酸標(biāo)記的融合蛋白的6 x區(qū)域，同時也為Ni-NTA-QDs與組氨酸標(biāo)記的蛋白在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行追蹤觀察提供了可能。M?nsson等［7］用鏈霉親和素包裹的量子點(diǎn)標(biāo)記肌動蛋白絲后在體外研究肌動蛋白絲的滑行，觀察到肌動蛋白絲滑行的時候沿著自己的長軸旋轉(zhuǎn)，用偏振顯微鏡檢測到量子點(diǎn)在三維空間中的定位，這為利用量子點(diǎn)在三維空間中研究肌動蛋白絲動態(tài)滑行過程提供了可能，也為對肌動球蛋白和其他生物分子的功能研究打開了新窗口。Hu等［8］用無機(jī)顆粒碳酸氫鈣包埋碲化鎘，形成了具有良好生物相容性的碳酸氫鈣碲化鎘顆粒，與肝癌細(xì)胞株共同培養(yǎng)，用熒光顯微鏡觀察了量子點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)的吸收和分布。同時通過激光掃描共聚焦顯微鏡監(jiān)控細(xì)胞對碳酸氫鈣碲化鎘的吸收過程，在前3個小時碳酸氫鈣碲化鎘聚集在肝癌細(xì)胞株細(xì)胞膜周圍，少量黏附在細(xì)胞膜上。經(jīng)過24 h的共同培養(yǎng)后，大部分碳酸氫鈣碲化鎘圍繞和黏附在細(xì)胞膜上，小部分進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)，共聚焦圖像提示進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的碳酸氫鈣碲化鎘位于溶酶體，顆粒通過與細(xì)胞的非特異性相互作用的吞噬路徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。該實(shí)驗(yàn)顯示了碳酸氫鈣碲化鎘進(jìn)入細(xì)胞的過程以及最后的定位的細(xì)胞器，這為以后的研究提供了新的方法。

2 量子點(diǎn)在對生物大分子識別和鑒定方面的應(yīng)用

由于人類基因組計(jì)劃還未完全發(fā)現(xiàn)人類基因組序列，而完成人類基因組序列需要通過DNA雜交的檢測，這就使得DNA雜交的檢測變得很重要。Jiang等［9］發(fā)現(xiàn)了一種利用水溶性量子點(diǎn)參與的級聯(lián)熒光能量轉(zhuǎn)移來檢測DNA雜交的新方法，用400 nm光激發(fā)二溴化聚乙烯、量子點(diǎn)和紅外線染料700染料標(biāo)記的DNA混合物，第一級聯(lián)反應(yīng)從二溴化聚乙烯到量子點(diǎn)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，第二級聯(lián)反應(yīng)從二溴化聚乙烯/量子點(diǎn)混合物到紅外線染料700染料標(biāo)記的DNA發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，該方法提供了可靠的信號感應(yīng)平臺，從而區(qū)別了互補(bǔ)與非互補(bǔ)的DNA，這為完成人類基因組計(jì)劃提供了可能。Giraud等［10］發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)標(biāo)記與熒光壽命成像顯微術(shù)聯(lián)合應(yīng)用是一種強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，量子點(diǎn)標(biāo)記的靶DNA雜交微陣列點(diǎn)熒光壽命分析顯示有18.8 ns的特征壽命值，與游離的量子點(diǎn)溶液所獲得的13.3 ns的特征壽命值相比，揭示了量子點(diǎn)標(biāo)簽對點(diǎn)微環(huán)境的敏感性，并用于對DNA雜交事件的檢測。Wu等［11］用緊湊的量子點(diǎn)探針通過高效的熒光能量轉(zhuǎn)移快速且敏感地檢測DNA，將量子點(diǎn)表面包裹羧基組和非功能化的氫氧根來減少空間障礙，合成量子點(diǎn)DNA探針，使功能化的量子點(diǎn)的尺寸在3 nm左右，并用這種量子點(diǎn)來檢測DNA，只需10 min即可在納摩爾檢測限內(nèi)完成DNA的快速檢測。Wu等［12］將量子點(diǎn)與巰基化的單鏈DNA結(jié)合，建立了一種量子點(diǎn)標(biāo)記DNA的熒光探針，通過熒光素原位雜交技術(shù)對大腸埃希菌pUC18質(zhì)粒上的多克隆位點(diǎn)序列進(jìn)行了研究。張渝陽等［13］利用碳納米管和碲化鎘QDs組裝的電化學(xué)傳感器建立了一種識別DNA的新方法，用羧基化碳納米管修飾在金電極上，用此電極固定5'端氨基探針DNA，以碲化鎘QDs為互補(bǔ)的目標(biāo)，DNA標(biāo)志物在溶液中雜交后通過差分脈沖檢測嵌合指示劑柔紅霉素的還原峰信號，從而定量檢測目標(biāo)DNA。標(biāo)記碲化鎘QDs的目標(biāo)DNA序列與未標(biāo)記碲化鎘QDs的目標(biāo)DNA相比，電流響應(yīng)敏感度明顯提高，從而建立了一種新的識別DNA的電化學(xué)傳感器。

3 量子點(diǎn)在生物大分子相互作用機(jī)制方面的應(yīng)用

用量子點(diǎn)標(biāo)記有關(guān)的生物分子，通過對量子點(diǎn)的測定即可實(shí)時觀測活體細(xì)胞內(nèi)部特定受體及生物分子之間的相互作用，研究活體細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞及其分子機(jī)制。Vu等［14］用量子點(diǎn)與神經(jīng)生長因子連接制備神經(jīng)生長因子-量子點(diǎn)探針，神經(jīng)生長因子-量子點(diǎn)探針與大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞表面的TrkA受體作用后，激活TrkA受體而引起大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，刺激神經(jīng)元分化，為量子點(diǎn)應(yīng)用于生物大分子間的相互作用研究提供了可能。Chen等［15］將三磷酸腺苷加入到Cy5標(biāo)記的DNA和量子點(diǎn)標(biāo)記的DNA溶液中，由于三磷酸腺苷與適配體間的相互作用引起適配體構(gòu)造的改變，使Cy5標(biāo)記的DNA從雜交復(fù)合體中釋放出來，從而觸發(fā)量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)和Cy5熒光強(qiáng)度減低，建立了一種量子點(diǎn)參與的有效率地檢測三磷酸腺苷的新方法。這種方法在將來可以更加深入地研究DNA與DNA或者DNA與蛋白質(zhì)的相互作用。Weng等［16］將量子點(diǎn)分別與抗von Willebrand因子抗體和植物凝集素進(jìn)行共價配對制備熒光量子點(diǎn)抗von Willebrand因子抗體和量子點(diǎn)植物凝集素，將其分別與相應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)免疫原和細(xì)胞膜受體進(jìn)行特異性結(jié)合，通過激光共焦掃描顯微鏡獲得了很好的細(xì)胞成像，證明了量子點(diǎn)在生物分子間相互作用的研究方面可提供直接可視化的直觀方法。

4 量子點(diǎn)在生物大分子運(yùn)動軌跡監(jiān)測方面的應(yīng)用

Ishihama等［17］將量子點(diǎn)標(biāo)記的mRNAs通過顯微注射入Cos7(猴腎成纖維細(xì)胞系)細(xì)胞的細(xì)胞核，在30 ms的時間分辨率下，成功地應(yīng)用量子點(diǎn)對mRNAs的運(yùn)動進(jìn)行實(shí)時動態(tài)觀察超過60 s，通過該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了mRNAs的擴(kuò)散只在染色質(zhì)區(qū)域內(nèi)而不是在核染色質(zhì)區(qū)域，這為mRNAs的擴(kuò)散渠道是在染色質(zhì)區(qū)域內(nèi)提供了直接證據(jù)。楊凱等［18］利用 QDs與Smad4單克隆抗體連接形成QDs-Smad4熒光探針，用于對牙乳頭細(xì)胞內(nèi)Smad4信號蛋白分子核移位過程進(jìn)行了檢測，證明了QDs和Smad4單抗共價結(jié)合形成分子探針后仍具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)和特異免疫識別能力，能長時間對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行成像標(biāo)記。Dahan等［19］用鏈酶親和素包裹的量子點(diǎn)與mAb2b抗體、生物素化的抗鼠Fab片段及甘氨酸受體共同作用形成量子點(diǎn)-甘氨酸受體探針，用于對神經(jīng)元上甘氨酸受體的檢測，通過激光共聚焦顯微鏡在從毫秒到分鐘的時期范圍內(nèi)跟蹤甘氨酸受體，分析它們在活細(xì)胞的神經(jīng)元膜上的外側(cè)動力學(xué)。通過電子顯微鏡觀察到量子點(diǎn)標(biāo)記的甘氨酸受體通過擴(kuò)散的方式進(jìn)入突觸，證實(shí)了擴(kuò)散的量子點(diǎn)甘氨酸受體精確地定位在神經(jīng)元膜上。

5 量子點(diǎn)在生物大分子定量檢測方面的應(yīng)用

由于量子點(diǎn)在生物大分子定量檢測中具有簡便、快速的特點(diǎn)，以及較高的特異性和敏感性，所以量子點(diǎn)用于生物大分子的定量檢測越來越多。Chen等［20］發(fā)明了基于量子點(diǎn)的免疫熒光技術(shù)定量檢測人類表皮生長因子Ⅱ在乳腺癌中的表達(dá)。在94例乳腺癌臨床病例中，通過用量子點(diǎn)定量檢測人類表皮生長因子Ⅱ在乳腺癌中的表達(dá)，提高了乳腺癌臨床診斷的精確度和敏感度。Zhang等［21］建立了夾心免疫熒光測定人甲胎蛋白抗原模型，將量子點(diǎn)與IgG抗體結(jié)合，同時用抗原包裹羧基聚苯乙烯微磁球，兩者通過抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合，可以對甲胎蛋白定量檢測到4.9 μg/L。Liu等［22］建立了一種基于細(xì)菌壁表面蛋白的量子點(diǎn)傳感器，應(yīng)用量子點(diǎn)標(biāo)記 IgG并通過離心分離出待測細(xì)菌，最后通過熒光測定來判斷金黃色葡萄球菌的濃度，該研究提供了一種快速、準(zhǔn)確的定量檢測方法。黃珊等［23］采用共振光散射方法研究了溶菌酶與量子點(diǎn)之間的相互作用，并利用量子點(diǎn)探針建立了檢測溶菌酶的新方法，檢出限達(dá)到5.2 nmol/L，并將此方法成功用于合成樣品中溶菌酶含量的測定。Yu等［24］用合成的功能化的碲化鎘/硫化鎘量子點(diǎn)QDs與克拉克魯布斯緩沖溶液和牛血清白蛋白液混合后用熒光分光光度法檢測熒光強(qiáng)度，當(dāng)克拉克魯布斯緩沖溶液的pH值為6.83時，碲化鎘/硫化鎘量子點(diǎn)QDs對牛血清白蛋白有很高的選擇性信號，且可以獲得最大熒光強(qiáng)度。這種方法為納米材料在化學(xué)分析和生物化學(xué)分析及定量定性檢測中的應(yīng)用開辟了道路。

6 展望

隨著納米科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的日臻完善，量子點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用顯示了巨大的學(xué)術(shù)價值和良好的商業(yè)前景。但量子點(diǎn)的應(yīng)用遠(yuǎn)不止于此，在光學(xué)、電子學(xué)、信息科學(xué)、藥學(xué)等研究領(lǐng)域里均得到了廣泛的研究。量子點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用是一個發(fā)展前景十分廣闊的研究領(lǐng)域。它在生物大分子的定位、功能、相互作用及運(yùn)動軌跡、定量和成像監(jiān)測等方面均得到了廣泛的應(yīng)用。將量子點(diǎn)應(yīng)用于活體內(nèi)目標(biāo)生物分子的實(shí)時、動態(tài)檢測目前已成為研究熱點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，相信量子點(diǎn)在科學(xué)研究中的作用必將會越來越大，必將為人類探索和解決實(shí)際問題提供巨大的幫助。

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