溶瘤腺病毒治療膀胱癌進(jìn)展

陳 猛，郝 林(綜述)，韓從輝※(審校)

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京210009;2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬徐州醫(yī)院泌尿外科，江蘇徐州221009)

膀胱腫瘤是我國泌尿外科最常見的腫瘤，約占全部惡性腫瘤的3.2%，且發(fā)病率逐年增高。在歐美一些國家，膀胱腫瘤在泌尿生殖系統(tǒng)中僅次于前列腺癌而居第二位。目前，治療膀胱癌的主要方法是以手術(shù)為主，輔以膀胱內(nèi)灌注化療和免疫治療藥物，但復(fù)發(fā)率高，治療效果遠(yuǎn)不能讓人滿意。溶瘤腺病毒又稱條件增殖型腺病毒，其在正常細(xì)胞中復(fù)制能力很低而在腫瘤細(xì)胞中則可以特異性復(fù)制，通過腺病毒的增殖來裂解腫瘤細(xì)胞，釋放出的子代腺病毒可以繼續(xù)感染周圍腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步殺傷腫瘤。自2003年首次報(bào)道溶瘤腺病毒治療膀胱腫瘤以來，人們對溶瘤腺病毒治療膀胱癌進(jìn)行了大量的研究。

1 腺病毒的生物學(xué)特征及特點(diǎn)

腺病毒(adenovirus)是一種由252個(gè)殼粒呈二十面體排列構(gòu)成的直徑為70～90 nm的無包膜雙鏈DNA病毒。腺病毒具有以下諸方面的優(yōu)點(diǎn):①嗜上皮細(xì)胞性;②既可以感染分裂期細(xì)胞又可以感染非分裂期細(xì)胞;③對人致病性低;④同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因;⑤外源性基因表達(dá)水平高;⑥插入外源基因容量大;⑦病毒基因組發(fā)生重排較少;⑧有效進(jìn)行增殖;⑨滴度高;⑩不整合到宿主染色體。人體腺病毒目前已經(jīng)鑒定有51個(gè)血清型。這51型腺病毒可以根據(jù)血凝反應(yīng)、對嚙齒類動物的致瘤性、DNA的同源性和基因組的結(jié)構(gòu)分為 A、B、C、D、E、F亞屬。目前應(yīng)用的腺病毒載體主要是在人類腺病毒C亞群的Ad2和Ad5的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。

腺病毒對細(xì)胞的感染始于纖維蛋白與靶細(xì)胞表面的腺病毒受體(coxsackievirus-adenovirus receptor，CAR)結(jié)合，腺病毒黏附后，五鄰體蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸序列與細(xì)胞表面的整合素ανβ3和ανβ5結(jié)合形成內(nèi)體使病毒進(jìn)入細(xì)胞，CAR起到黏附病毒的作用，整合素起到了內(nèi)化病毒的作用，他們各司其職，相互配合。兩者對于腺病毒的感染是缺一不可的。

2 溶瘤腺病毒的構(gòu)建機(jī)制

目前認(rèn)為，細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，是腺病毒復(fù)制的必要條件。E2F轉(zhuǎn)錄因子可使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，而視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白可與E2F結(jié)合，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。腺病毒感染細(xì)胞后，E1A蛋白與Rb蛋白結(jié)合釋放E2F，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，但E2F同時(shí)也促進(jìn)p14ARF和cyclin E等物質(zhì)的產(chǎn)生，其中p14ARF通過Mdm2(泛素連接酶途徑)減少p53降解并在核仁周圍聚積;p53與細(xì)胞周期停滯基因和凋亡誘導(dǎo)基因上游的p53反應(yīng)子結(jié)合從而阻止細(xì)胞進(jìn)入S期或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而E1b蛋白可與p53結(jié)合并使之失活，最終使大量宿主細(xì)胞由靜止期進(jìn)入分裂期，腺病毒得以復(fù)制。

可見E1A和E1B基因是腺病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制所必需的基因，通過改變或調(diào)控E1A和(或)E1B基因就可以構(gòu)建相應(yīng)的溶瘤腺病毒，如去除E1A或E1B基因的腺病毒在Rb和p53細(xì)胞信號通路正常的宿主細(xì)胞中無法進(jìn)行復(fù)制增殖，但在Rb或p53信號通路異常的腫瘤細(xì)胞中則可以增殖并使細(xì)胞受損。

3 溶瘤腺病毒治療膀胱癌的研究

3.1 E1B缺失腺病毒治療膀胱癌 p53基因突變是人膀胱癌中最常見的基因缺陷，大約50%的膀胱癌發(fā)生p53基因突變，且p53基因突變與移行細(xì)胞癌的高分期、高分級相關(guān)。腺病毒的E1B-55蛋白可以結(jié)合p53并使之失活，從而促使腺病毒復(fù)制。Hsieh等［1，2］構(gòu)建了 E1B 缺失腺病毒 Ad5WS1，研究發(fā)現(xiàn)Ad5WS1可在p53突變的J82和TCC-SUP細(xì)胞中復(fù)制，J82細(xì)胞中的腺病毒產(chǎn)量是在293細(xì)胞中的10.34倍，但在TSGH-8301和BFTC-905中分別是293細(xì)胞的0.87%和1.52%。BFTC-173-12細(xì)胞感染Ad5WS1出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞病變效應(yīng):感染3 d后，細(xì)胞生存率降到了50%。

3.2 E1A突變腺病毒治療膀胱癌 Fueyo等［3］通過刪除E1A區(qū)域的24 bp構(gòu)建了溶瘤腺病毒Δ24，Δ24腺病毒可以高效地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并溶解腫瘤細(xì)胞。研究顯示，Δ24感染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞10～14 d后可觀察到大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞溶解。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示，單劑量使用Δ24腺病毒可導(dǎo)致裸鼠66.3%的腫瘤生長抑制，而多次注射Δ24腺病毒抑制腫瘤生長可高達(dá)83.8%。但正常的成纖維細(xì)胞和Rb活性正常的癌細(xì)胞可抵抗 Δ24腺病毒。Wang等［4］研究發(fā)現(xiàn)，E1A突變腺病毒dl 922-947對膀胱癌細(xì)胞株J82 5637和T24的細(xì)胞病變效應(yīng)要大于E1B-55KD缺失腺病毒AxE1AdB，但未報(bào)道這種差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 E1A突變和E1B缺失雙限制腺病毒治療膀胱癌 Wang等［4］構(gòu)建了E1A突變和E1B-55缺失腺病毒 AxdAdB-3，并以 E1區(qū)缺失腺病毒 AxCAlacZ，E1B-55缺失腺病毒 AxE1AdB和E1A突變腺病毒dl 922-947為對照組進(jìn)行體外和體內(nèi)研究AxdAdB-3的治療膀胱癌效果。體外研究結(jié)果顯示，AxdAdB-3比AxE1AdB和dl922-947有更大的細(xì)胞病變作用;體內(nèi)研究結(jié)果顯示，AxdAdB-3治療的膀胱腫瘤體積最小，重量比對照組明顯減小。AxdAdB-3治療的小鼠生存率明顯增加，且多次灌注比單次灌注更明顯的增加了小鼠的生存率。此外，AxdAdB-3比單突變腺病毒對正常細(xì)胞有更小的毒性。

3.4 特異性啟動子調(diào)控溶瘤腺病毒治療膀胱癌Terao等［5］構(gòu)建了由肝素結(jié)合細(xì)胞因子(midkine，MK)啟動子控制E1A基因的腺病毒(Ad-MK-E1A)并檢測了Ad-MK-E1A在細(xì)胞中的復(fù)制能力，轉(zhuǎn)染率以及細(xì)胞毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MK mRNA高表達(dá)的細(xì)胞系(KK47，5637)比MK mRNA低表達(dá)的細(xì)胞系(T24，H891)含有更多的E1A DNA;對KK47、5637、T24、A549 和H891 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率分別為(3.2×1010±0.9×1010)BTU/mL，(5.7 ×109±0.7 ×109)BTU/mL，1.0 ×107BTU/mL，(1.35×109±0.35 ×1010)BTU/mL，和(3.8 ×109±0.1×109)BTU/mL;Ad-MK-E1A不能抑制H891細(xì)胞的生長，在第7 天，21%的 T24，35.5%的 A549，56.8%的KK47和71.6%的5637細(xì)胞生長被抑制。隨后用KK47細(xì)胞建立了皮下腫瘤動物模型進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果Ad-MK-E1A明顯抑制腫瘤生長。

Shirakawa等［6］構(gòu)建了由環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2，Cox-2)啟動子控制E1A基因的腺病毒(AdE3-cox2-327)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AdE3-cox2-327不能抑制T24、PC3、Colo320、PF 和 H358 細(xì)胞生長，但能明顯抑制表達(dá)Cox-2和CAR的KK47，5637和A549細(xì)胞生長。KK47、5637和A549細(xì)胞比H358細(xì)胞含有更多的E1A DNA，這證實(shí)了AdE3-cox2-327是有選擇性地復(fù)制。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AdE3-cox2-327比Ad5CMV-LacZ和空白對照組更能抑制KK47腫瘤的生長。

Oct-3/4高表達(dá)于膀胱腫瘤，而不表達(dá)于正常成熟細(xì)胞組織，它在腫瘤生成過程中起著重要的作用［7，8］。Wu 等［9］構(gòu) 建 了 由 ORE(Oct-3/4 response element)結(jié)合CMVmini啟動子控制的E1B缺失腺病毒Ad.9OC。研究發(fā)現(xiàn)，Ad.9OC的細(xì)胞溶解性效應(yīng)與Oct-3/4的表達(dá)水平呈正相關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Ad.9OC比Ad5WS1(E1B-55×103闕如腺病毒)具有更強(qiáng)的細(xì)胞溶解性效應(yīng)。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ad.9OC增加了MBT-2/LM7腫瘤小鼠的生存率，但僅少許增加了MBT-2腫瘤小鼠的生存率。

Ramesh等［10］用 E2F-1啟動子和編碼 GM-CSF的cDNA分別取代了Ad5的E1A啟動子和E3gp19×103編碼區(qū)構(gòu)建了溶瘤腺病毒CG0070。研究發(fā)現(xiàn)在Rb途徑缺陷的細(xì)胞中，CG0070中的E2F啟動子可以調(diào)控E1A基因的轉(zhuǎn)錄和下游調(diào)節(jié)人GMCSF的E3啟動子的表達(dá)。在Rb途徑缺陷的人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系RT4、SW780、UC14和253J B-V中，CG0070和野生型腺病毒Ad5一樣產(chǎn)生相似水平的子代病毒(3000～9000 PFU/細(xì)胞);而在Rb陽性的正常細(xì)胞中，CG0070的復(fù)制能力急劇衰弱。以3×1010、3×109、3×108的 CG0070病毒量和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)分別瘤內(nèi)注射治療進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)60 d后PBS組的腫瘤體積增加了10.6倍，3×109、3×108CG0070Z 組的腫瘤體積增加了2倍，而3×1010CG0070組的腫瘤體積降至85%;最高劑量CG0070治療組有一半(5/10)腫瘤完全退化。

Melquist等［11］構(gòu)建了由骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)啟動子調(diào)控 E1A基因的腺病毒Ad-BSP-E1A。研究發(fā)現(xiàn)BSP陰性，CAR陽性的253J和253J B-V細(xì)胞易于感染Ad-BSP-E1A，BSP和CAR陰性的T24細(xì)胞是耐Ad-BSP-E1A的。BSP和CAR陽性的RT4細(xì)胞非常易感Ad-BSP-E1A。動物試驗(yàn)中PBS和Ad-BSP-TK治療3周后的腫瘤平均體積分別增加了140%和67%，而Ad-BSP-E1A組減少了10%。治療7周后，PBS組腫瘤體積增加了2000%，而Ad-BSP-E1A和Ad-BSP-TK組分別增加了45%和76%。但由于樣本量較小，難以評估其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

尿溶蛋白(uroplakins，UPs)是一組哺乳動物尿路上皮分化時(shí)合成的高度保守的膜內(nèi)在蛋白。Zhang等［12］在E1A上游插入hUPⅡ啟動子，用TRES連接E1A和E1B區(qū)構(gòu)建了腺病毒CV876，而后在CV876的基礎(chǔ)上刪除E1B-19×103編碼區(qū)構(gòu)建了腺病毒CG8840。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，CV876和 CG8840在 RT4和SW780細(xì)胞中能很好地復(fù)制，但在非膀胱細(xì)胞中(G316、LNCaP、hLFs和 hBSMCs)復(fù)制能力很差。CG8840在膀胱癌細(xì)胞中比CV876有更大的病毒釋放量，而在非膀胱癌細(xì)胞中復(fù)制能力相似。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CG8840瘤內(nèi)注射治療5周后腫瘤體積減小到50%而空白對照組腫瘤體積增加到310%。聯(lián)合治療試驗(yàn)顯示多西紫杉醇治療10 d后存活了50%的細(xì)胞，而多西紫杉醇聯(lián)合CG8840治療10 d后，全部細(xì)胞被殺死。等效線圖解法說明CG8840和多西紫杉醇具有協(xié)同作用。同樣，CG8840聯(lián)合其他化療藥物，如多柔比星、絲裂霉素C、塞替哌、米托蒽醌和長春堿也具有協(xié)同作用。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，治療7周后，空白對照組腫瘤增加320%，然而CG8840和聯(lián)合組(CG8840聯(lián)合多西紫杉醇)腫瘤減小甚至沒有腫瘤。治療5周時(shí)，CG8840組的6只小鼠中有2只觸及不到腫瘤，還有2只小鼠的腫瘤減小了50%以上;聯(lián)合組的6只小鼠中3只小鼠沒有腫瘤，另外3只小鼠的腫瘤減小了80%。由于UPⅡ也表達(dá)于正常的膀胱組織，Wang等［13］在UPⅡ啟動子上游插入腫瘤特異性前列腺干細(xì)胞抗原強(qiáng)化因子來限制其在非膀胱細(xì)胞中的活性。研究表明，腫瘤特異性前列腺干細(xì)胞抗原強(qiáng)化因子聯(lián)合UPⅡ啟動子構(gòu)建膀胱癌特異性載體是可行的。

Lanson等［14］用人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)啟動子調(diào)控E1基因的表達(dá)構(gòu)建了腺病毒Ad5-hTERT-E1。研究表明，Ad5-hTERT-E1可以在所有的腫瘤細(xì)胞中(HT-1080、HeLa、A549、HepG2、SCC-4、SCC-5、SCCLSU-1、T24 和DU145)導(dǎo)致細(xì)胞溶解而對正常細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞)則沒有作用。

在腫瘤增殖過程中發(fā)生缺氧是一種普遍現(xiàn)象，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)許多基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)生變化，對缺氧作出應(yīng)激反應(yīng)，這些反應(yīng)主要是通過缺氧啟動子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)完成的。李懷富等［15，16］研究30 例正常膀胱組織未發(fā)現(xiàn) HIF-1α 陽性表達(dá)，80例膀胱組織中有43例HIF-1α表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率占53.75%。其表達(dá)與腫瘤的大小、部位、數(shù)目、病理分級以及患者年齡無關(guān)，但與腫瘤的臨床分期及分級明顯相關(guān)。隨后構(gòu)建了由hTERT啟動子控制E1A基因，HIF-1啟動子控制E1B基因的雙調(diào)控溶瘤腺病毒，使其更加特異地在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)而在正常細(xì)胞中不表達(dá)，并以此為超抗原SEA基因載體進(jìn)一步包裝成溶瘤腺病毒-hTERT-缺氧啟動子-超抗原復(fù)合物(RSOAds-hTERT-HIF-SEA)，該復(fù)合物既具有高效的靶向膀胱腫瘤特點(diǎn)，又具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞刺激能力，同時(shí)又能夠直接裂解殺傷腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而對膀胱腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的多重靶向治療效果。胡建鵬等［17］將淋巴細(xì)胞與膀胱腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)12、24、48 h，加入該溶瘤腺病毒組的腫瘤細(xì)胞明顯少于對照組，酶聯(lián)免疫吸附法檢測白細(xì)胞介素4分泌量，實(shí)驗(yàn)組均高于對照組。

4 存在的問題和展望

首先，膀胱上皮的氨基葡聚糖層作為非特異性隔離屏障可能阻礙腺病毒的感染能力，十二烷基-β-D麥芽糖苷或十二烷基硫酸鈉預(yù)處理的膀胱使用腺病毒15 min后有＞90%膀胱層轉(zhuǎn)染腺病毒，而未處理的膀胱≤5%轉(zhuǎn)染腺病毒［18，19］。不過使用藥物消除或減弱氨基葡聚糖層可以使腺病毒到達(dá)膀胱上皮表面而提高治療效果。

其次，膀胱癌的CAR表達(dá)下降將降低溶瘤腺病毒的感染能力，進(jìn)而影響到治療效果。Li等［20］研究發(fā)現(xiàn)，RT4和253J膀胱癌細(xì)胞株易于感染腺病毒，而TCC和T24膀胱癌細(xì)胞株卻抵抗腺病毒感染，而后檢測到RT4細(xì)胞的CAR是T24的20倍左右。Sachs等［21］報(bào)道正常膀胱上皮、淺表性膀胱癌和浸潤性膀胱癌的CAR表達(dá)分別為90.0%、83.3%和31.3%，低分級TCC和高分級TCC細(xì)胞的CAR表達(dá)分別為83.3%、39.5%，CAR的表達(dá)與膀胱癌的分期與分級相關(guān)。因此，如何增加腺病毒治療低表達(dá)甚至不表達(dá)CAR的膀胱癌也是一個(gè)急需解決的問題。Shieh等［22］研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的依托泊苷可以上調(diào)膀胱癌的CAR表達(dá)水平。此外，改變腺病毒的感染途徑也可以增加它對CAR缺乏細(xì)胞的感染性和特異性，一種方法是修飾腺病毒基因組來改變腺病毒衣殼的結(jié)合特異性，另一種是在腺病毒的衣殼上銜接一個(gè)具有特異性結(jié)合親和力的耦聯(lián)蛋白。

最后，溶瘤腺病毒治療膀胱癌還需要大量的臨床試驗(yàn)，將溶瘤腺病毒用于臨床治療膀胱癌還有一段距離。相信，隨著科學(xué)的進(jìn)步，對膀胱癌研究的深入和生物工程、基因工程的發(fā)展，總有一天人們會攻克膀胱癌。

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