生長因子對肌腱細(xì)胞表型及分化的影響

邱軼偉(綜述)，朱理瑋(審校)

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普通外科，天津300052)

肌腱斷裂是外科難題，不但修復(fù)起來很困難而且人們對肌腱的愈合過程知之甚少。依靠對細(xì)胞的生化過程進(jìn)行操控，組織工程可以改善目前肌腱和韌帶損傷后外科手術(shù)效果［1-3］。目前肌腱組織工程中的關(guān)鍵因素有三個(gè):細(xì)胞支架、肌腱細(xì)胞和宿主反應(yīng)［4，5］。本篇綜述將對肌腱細(xì)胞研究中的幾個(gè)難點(diǎn)進(jìn)行討論。目前肌腱細(xì)胞體外培養(yǎng)中的難點(diǎn)在于，首先，從肌腱中提取的肌腱細(xì)胞非常稀少，然而過多的傳代培養(yǎng)將導(dǎo)致肌腱細(xì)胞表型的變異［6］;其次，肌腱細(xì)胞的體外培養(yǎng)依賴大量的動(dòng)物血清添加于培養(yǎng)基中以達(dá)到細(xì)胞的存活和增殖，而動(dòng)物血清的使用會(huì)增加未來移植時(shí)對宿主的疾病傳播的可能性。

肌腱細(xì)胞存在于肌腱中，沿肌腱膠原纖維的長軸平行排列，這些細(xì)胞可以依靠特異的細(xì)胞突起和間隙連接形成的壓力感受系統(tǒng)以達(dá)到細(xì)胞之間的互相交流，這樣肌腱細(xì)胞就可以調(diào)控它們的細(xì)胞外基質(zhì)。對于組織工程來講，能夠維持細(xì)胞表型是最基本的要求［7］。然而，有研究顯示［8］，兔的肌腱細(xì)胞數(shù)次傳代培養(yǎng)后即出現(xiàn)了表型的變異，人跟腱提取的肌腱細(xì)胞在體外培養(yǎng)8次傳代后即出現(xiàn)了明顯的表型變異。這些表型變異體現(xiàn)在肌腱細(xì)胞的生長特性和細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化。細(xì)胞外基質(zhì)的纖絲樣和非纖絲樣成分，基質(zhì)-細(xì)胞相互作用的遞質(zhì)均可作為肌腱細(xì)胞的表型變異以及肌腱細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物。

已有學(xué)者試圖在肌腱細(xì)胞的體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入生長因子以達(dá)到促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖和分化的目的，然而，多種生長因子的相互作用在無血清條件下對于肌腱細(xì)胞的作用人們?nèi)圆磺宄?。在這篇綜述中，首先對肌腱細(xì)胞的表形標(biāo)志物進(jìn)行討論，然后討論那些有可能在無血清狀態(tài)下維持肌腱細(xì)胞表型的生長因子。

1 肌腱表型標(biāo)志物

1.1 Ⅰ型膠原 正常肌腱內(nèi)的主要結(jié)構(gòu)的組成就是Ⅰ型膠原，Ⅰ型膠原占超過肌腱干重量的70%。在肌腱內(nèi)，膠原纖維的分布是縱行層結(jié)構(gòu)分布，也就是說從最纖細(xì)的微纖維，次纖維和纖維分層有序的排列以形成肌腱的組織架構(gòu)。Ⅲ型膠原是膠原纖維家族成員之一，其與Ⅰ型膠原結(jié)構(gòu)類似但其為同源三聚體分子(Ⅰ型膠原為異源三聚體分子)。Ⅲ型膠原的單體鏈依靠永久性二硫鍵結(jié)合在一起，而在Ⅰ型膠原中，其單體鏈依靠暫時(shí)性C-前肽二硫鍵結(jié)合。有研究認(rèn)為，Ⅲ型膠原在Ⅰ型膠原纖維的形成過程中起重要作用，因?yàn)棰笮湍z原能夠經(jīng)常與Ⅰ型膠原共存，甚至有研究報(bào)道在同一個(gè)肌腱纖維里同時(shí)發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅲ型膠原［9］。Ⅲ型膠原在肌腱中存在的量非常小，然而，一旦出現(xiàn)肌腱損傷或者斷裂，Ⅲ型膠原的比例就會(huì)顯著增加，Ⅲ型膠原增加后的結(jié)果就是肌腱的力學(xué)特性嚴(yán)重變差。使用兔肌腱細(xì)胞進(jìn)行體外單層長期培養(yǎng)的結(jié)果就是，Ⅰ型膠原的產(chǎn)生隨傳代次數(shù)的增加明顯減少。

1.2 Scleraxis Scleraxis是堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，它是非常特異的結(jié)締組織標(biāo)志物，而這些結(jié)締組織正是調(diào)控雞和鼠的肌肉與骨的連接部位，包括四肢的肌腱。最早小鼠Scleraxis基因的發(fā)現(xiàn)是在尋找一種新的組織特異的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白的過程中發(fā)現(xiàn)的，借助于這些蛋白易與廣泛存在的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白易于形成異源二聚體的優(yōu)勢發(fā)現(xiàn)的小鼠Scleraxis基因。Scleraxis選擇性地表達(dá)于肌腱細(xì)胞，而且不但調(diào)控肌腱細(xì)胞內(nèi)的Ⅰ型膠原的基因表達(dá)［10］，而且還調(diào)控肌腱細(xì)胞分化標(biāo)志物Tenomodulin的基因表達(dá)［11］。Scleraxis基因剔除的研究顯示，Scleraxis在肌腱發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的作用。Scleraxis基因缺失的小鼠不但嚴(yán)重缺乏肌腱導(dǎo)致腿，背和尾部的活動(dòng)受限，同時(shí)肌腱內(nèi)肌腱細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)混亂排列?；谏鲜鼋Y(jié)果，有理由認(rèn)為，Scleraxis通過調(diào)控Ⅰ型膠原在肌腱細(xì)胞分化和肌腱組織形成過程中起到至關(guān)重要的作用［12］。

1.3 Decorin Decorin是存在于包括肌腱在內(nèi)的多種結(jié)締組織中細(xì)胞外基質(zhì)中的低分子量蛋白多糖。從肌腱中提取的Decorin對于Ⅰ型和Ⅱ型膠原纖維的形成有抑制作用，并且可以降低膠原纖維的直徑［11］。然而，Decorin不僅僅抑制膠原纖維的形成，有研究顯示Decorin同時(shí)具有調(diào)控膠原纖維形成的作用。目前還無法清晰闡述Decorin調(diào)控膠原纖維生成的機(jī)制，但有學(xué)者提出假說認(rèn)為，Decorin減緩平行生長的膠原纖維融合以得到肌腱內(nèi)更均勻、更細(xì)的膠原纖維［12］。Decorin不但能夠使得肌腱內(nèi)的膠原纖維更有序排列，而且還能穩(wěn)定膠原纖維的形成過程［13］。更重要的是，Decorin借助其在肌腱中的膠原纖維表面的相互作用以影響肌腱的強(qiáng)度和彈性。

1.4 Tenomodulin Tenomodulin是一個(gè)Ⅱ型跨膜糖蛋白家族中的一員，它主要表達(dá)于肌腱，韌帶和眼，這個(gè)家族的其他成員ChondromodulinⅠ主要表達(dá)于軟骨，只有少量表達(dá)于眼和胸腺［12］?？寺⌒∈骉enomodulin全長cDNA后顯示其與小鼠ChondromodulinⅠ全長cDNA的前體有33%相同［12］。然而，Tenomodulin缺乏Chondromodulin所具備的激素處理信號，提示Tenomodulin是具有細(xì)胞表面的Ⅱ型跨膜蛋白的功能。Shukunami等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，雖然肌肉纖維和肌腱外膜都被定義為少血管的致密結(jié)締組織，但Tenomodulin的mRNA基因表達(dá)與肌肉纖維無關(guān)聯(lián)性，但與肌腱外膜關(guān)聯(lián)密切。有研究顯示，Tenomodulin缺陷小鼠的新生肌腱中嚴(yán)重缺乏可增殖的肌腱細(xì)胞，所以Tenomodulin對于肌腱細(xì)胞的增殖和成熟是必不可少的［15］。Shukunami等［11］認(rèn)為在雞的發(fā)育過程中，Tenomodulin的表達(dá)與肌腱細(xì)胞密切相關(guān)，而且被Scleraxis正向調(diào)控，研究結(jié)果提示，Tenomodulin是肌腱形成的后期標(biāo)志物，而且 Scleraxis對于Tenomodulin的表達(dá)的調(diào)控是依賴于肌腱細(xì)胞系的。有研究顯示，在肌肉生長抑制素基因剔除的小鼠肌腱細(xì)胞內(nèi)的Scleraxis和Tenomodulin的表達(dá)較未剔除的小鼠明顯降低，但這些肌腱細(xì)胞再給予了能夠激活p38MAPK和Smad2/3信號級聯(lián)系統(tǒng)肌肉生長抑素處理后，Scleraxis和Tenomodulin的表達(dá)均得到了提高［16］。

2 可促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖和分化的生長因子

2.1 胰島素樣生長因子1 胰島素樣生長因子最早被發(fā)現(xiàn)的時(shí)候被稱為“硫酸化因子”，因?yàn)樗且环N具備生長激素下游反應(yīng)的能夠刺激軟骨硫酸化的血清因子。后來因?yàn)槠淠軌虼碳ぜ?xì)胞增長又被命名為促生長因子。與此同時(shí)，其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)一種血清因子具有胰島素樣活性，但是其活性不能被抗胰島素抗體所抑制，所以被命名為“不可抑制的胰島素樣活性”。局部作用的胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor，IGF-1)可以直接與其受體結(jié)合，而進(jìn)入循環(huán)的IGF-1要與血清中的六種IGF結(jié)合蛋白(IGFBP-1～6)中的一種相結(jié)合，主要是IGFBP-3［17］。當(dāng)IGF結(jié)合蛋白裂解后，IGF與其分離，在其他結(jié)合蛋白的幫助下離開血管進(jìn)入目標(biāo)組織，再與其細(xì)胞表面的IGF-1酪氨酸激酶受體結(jié)合后引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［17］。

循環(huán)IGF-1大多在肝臟在生長激素的作用下合成［17］。局部作用的IGF-1可以從很多不同的組織中產(chǎn)生，例如，角質(zhì)形成細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，在這些細(xì)胞中IGF-1的合成是由生長激素和甲狀旁腺激素所調(diào)控。性激素可以在子宮中調(diào)控IGF-1的合成。在人類胎兒大部分組織中均存在IGF-1，其在胎兒中對發(fā)育的作用是極其重要的。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IGF-1對成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、甲狀腺濾泡細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腎小球膜網(wǎng)織紅細(xì)胞、卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、精原細(xì)胞的發(fā)育均有重要作用。IGF-1可以與如此多的細(xì)胞類型相結(jié)合，所以IGF-1具有廣泛的生理和病理作用。局部作用的IGF-1在傷口愈合方面也有相當(dāng)重要的作用，局部缺乏IGF-1嚴(yán)重影響愈合過程，局部外用IGF-1可以逆轉(zhuǎn)激素的不良反應(yīng)。

已經(jīng)有學(xué)者研究了IGF-1在肌腱愈合方面的作用。目前尚無發(fā)表的研究結(jié)果能夠顯示肌腱損傷后存在IGF-1的水平升高。體外兔肌腱細(xì)胞培養(yǎng)的研究顯示，重組的IGF-1對于肌腱細(xì)胞增殖與基質(zhì)合成有顯著的刺激作用，此作用在10～250 μg/L的范圍內(nèi)為劑量依賴性。在膠原酶誘導(dǎo)的肌腱炎的動(dòng)物模型中，局部注射IGF-1的肌腱愈合效果要優(yōu)于注射生理鹽水對照組。經(jīng)過了3～4周的治療，與對照組相比，注射IGF-1的實(shí)驗(yàn)組水腫較輕，肌腱強(qiáng)度加大，缺損較小，肌腱細(xì)胞增殖和膠原產(chǎn)生增加。

2.2 堿性成纖維細(xì)胞生長因子 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)最早是從牛垂體提純出來的具有對成纖維細(xì)胞促有絲分裂作用的物質(zhì)。后來這種物質(zhì)還具有對于細(xì)胞的其他特性，例如，促進(jìn)血管再生、促進(jìn)傷口愈合及胚胎發(fā)育的作用。從傷口愈合的角度講，bFGF對于角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移有促進(jìn)作用［18］。還能促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原酶［19］，刺激毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，不但這些都對新生血管的產(chǎn)生是必要的，而且還能夠促進(jìn)肉芽組織的產(chǎn)生。堿性成纖維細(xì)胞生長因子參與了各個(gè)器官的發(fā)育、重建，包括新生血管的產(chǎn)生、動(dòng)脈粥樣硬化的形成、血管損傷后的內(nèi)皮修復(fù)、肺的發(fā)育、神經(jīng)的發(fā)育、眼睛的發(fā)育、前列腺的發(fā)育、肌肉的發(fā)育以及傷口愈合［20］。有研究報(bào)道，外用bFGF可加速髕韌帶肌腱損傷模型的愈合，其機(jī)制可能為bFGF有效刺激了肌腱細(xì)胞的增殖。這個(gè)結(jié)果與其他研究人員的研究結(jié)果相一致，將bFGF注入損傷髕韌帶肌腱損傷模型中，其Ⅲ型膠原與肌腱細(xì)胞的增殖均有明顯的提高［21］。有研究指出，屈肌腱受損后修復(fù)過程中的第1～56天，肌腱內(nèi)的bFGF的水平明顯升高;腱鞘內(nèi)的肌腱細(xì)胞，成纖維細(xì)胞以及炎性細(xì)胞內(nèi)的bFGF水平達(dá)到了最高，這些結(jié)果均顯示bFGF在肌腱愈合過程中起到了相當(dāng)重要的作用［20］。外用bFGF可導(dǎo)致肌腱細(xì)胞的Integrin表達(dá)增加，而Integrin調(diào)控細(xì)胞之間，細(xì)胞與基質(zhì)之間的聯(lián)系，提示肌腱損傷后bFGF協(xié)調(diào)肌腱的愈合過程。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，與小劑量(3 μg/L)bFGF相比，大劑量(30 μg/L)的bFGF對于肌腱細(xì)胞的的增殖，細(xì)胞密度和基因表達(dá)均有強(qiáng)烈的抑制作用。應(yīng)用大劑量的bFGF 14和28 d后，肌腱細(xì)胞的Ⅰ型膠原，Ⅲ型膠原和纖連蛋白的表達(dá)較對照組明顯降低。所以，可以假設(shè)bFGF對于細(xì)胞的影響是劑量依賴性的。

2.3 血小板衍生生長因子 血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)最早是從血小板內(nèi)衍生出來的能夠刺激成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖的促有絲分裂物質(zhì)。目前很多研究的方向就是為了闡明PDGF在創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮作用的機(jī)制，特別是因?yàn)镻DGF是急性創(chuàng)傷后最早出現(xiàn)的生長因子。在早期的創(chuàng)傷愈合中，PDGF誘導(dǎo)其他生長因子的合成，例如，IGF-1，而且PDGF是在成纖維細(xì)胞增殖和分化，膠原的沉積以及新生血管的產(chǎn)生的級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的初始步驟［22］。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，PDGF刺激肌腱細(xì)胞的膠原和蛋白多糖的產(chǎn)生以及DNA合成。因?yàn)镻DGF上調(diào)IGF-1和IGF-1受體的表達(dá)，所以PDGF有可能通過非直接的方式對IGF-1的作用進(jìn)行控制。有研究顯示，1 μg/L PDGFBB可以逆轉(zhuǎn)10－6mol/L地塞米松所造成的肌腱細(xì)胞增殖速率減慢和膠原形成減少［23］。所以，PDGF對于不同的細(xì)胞可以有許多不同的作用，包括刺激細(xì)胞增殖、膠原產(chǎn)生和新生血管的產(chǎn)生。

2.4 轉(zhuǎn)化生長因子β 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)最早在 1983 年被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初這是一種胎盤衍生物并能夠刺激成纖維細(xì)胞在軟凝膠中增殖。自從被發(fā)現(xiàn)以后，就廣泛引起關(guān)注和作為研究的對象，因?yàn)榇宋镔|(zhì)的生物活性作用范圍很廣，而且在全身各個(gè)組織中均存在其作用部位。TGF-β幾乎在全身各種細(xì)胞中都可以產(chǎn)生，而且?guī)缀趺糠N細(xì)胞均對其有反應(yīng)［24］。TGF-β在不同的細(xì)胞中有不同的作用，有些包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，胚胎形成及器官發(fā)育［16］。在創(chuàng)傷愈合方面，TGF-β從脫顆粒的血小板中釋放出來，同時(shí)被各種參與愈合的各種細(xì)胞分泌出來，這些細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞［25］。數(shù)個(gè)研究表明，外用TGF-β可以逆轉(zhuǎn)因?yàn)槟挲g和激素的使用造成的傷口愈合不良［20］。然而，TGF-β除了具有促進(jìn)愈合的作用以外，它的另外一個(gè)作用就是過多的無序膠原沉積使其成為組織纖維化和瘢痕形成的主要因子。在傷口愈合，腎小球腎炎和肝硬化的動(dòng)物模型中，TGF-β水平的升高與病理性瘢痕形成有密切關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，在肌腱損傷以后，肌腱外膜和肌腱內(nèi)的TGF-β的mRNA水平均有顯著升高，特別是富含肌腱細(xì)胞的腱鞘部位，在上述相同部位的TGF-β受體的表達(dá)也有升高［25］。體外培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的研究表明，培養(yǎng)基中加入1～5 μg/L的TGF-β的三種同工型均可使得肌腱細(xì)胞的膠原產(chǎn)生增多，但同時(shí)也減少細(xì)胞數(shù)量［26］。

3 小結(jié)

該文肌腱細(xì)胞外基質(zhì)的纖維性的和非纖維性的組成部分可以用于作為肌腱細(xì)胞表型的標(biāo)志物以及可能會(huì)對肌腱細(xì)胞的增殖和分化造成影響的幾種生長因子。這些肌腱細(xì)胞表型標(biāo)志物可以用于判斷肌腱細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的功能性的變化，借此幫助研究者了解各種生長因子及其組合應(yīng)用于肌腱細(xì)胞后對其產(chǎn)生的作用。

目前已有數(shù)項(xiàng)研究致力于在體外培養(yǎng)肌腱細(xì)胞時(shí)在培養(yǎng)基內(nèi)加入生長因子，以期減少胎牛血清的使用。然而，這些研究所采用的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較短，使用的生長因子較為單一，且所得到的結(jié)果不甚統(tǒng)一，無法適用于組織工程學(xué)所需要的長期培養(yǎng)。所以，研究方向的假說就是，在肌腱細(xì)胞的體外培養(yǎng)中使用多種生長因子的組合使之有可能模擬體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境，使得肌腱細(xì)胞可以充分利用培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)以使得胎牛血清變得可有可無。該文所提到的幾種生長因子的正確組合非常有可能幫助建立一個(gè)無血清的體外培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的環(huán)境，并能促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)對于肌腱細(xì)胞表型變化的研究能使人們對肌腱組織工程有進(jìn)一步的了解。

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