造紙黑液與無機肥對草地早熟禾抗寒性的影響比較

文秋明，莫海濤，張小勇

(1.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190；2.中國科學院研究生院，北京 100049)

造紙黑液與無機肥對草地早熟禾抗寒性的影響比較

文秋明1，2，莫海濤1，張小勇1

(1.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190；2.中國科學院研究生院，北京 100049)

在晚秋自然降溫過程中，通過對草地早熟禾(Poapratensis)葉片生理生化指標和表觀品質的跟蹤測定、比較，研究了造紙黑液和無機肥對草地早熟禾抗寒性的影響。結果表明，造紙黑液和無機肥不同程度地提高了草地早熟禾抗寒鍛煉的效果。無機肥顯著促進了草地早熟禾葉片游離脯氨酸(Fpro)的積累，最大含量為868.95 μg/g。造紙黑液顯著提高了草地早熟禾葉片的超氧化物歧化酶(SOD)活性和可溶性糖(WSS)含量，最大值分別為201.16 U/g和137.15 μg/g。無機肥處理延長草坪綠期約10 d，造紙黑液處理延長草坪達40 d。相對于無機肥，造紙黑液更為顯著地提高了草地早熟禾的抗寒性，并保持了較高的草坪觀賞性。

草地早熟禾；生理生化指標；造紙黑液；抗寒性；抗寒鍛煉

草坪具有美化環(huán)境、保持水土、吸塵殺菌、制造氧氣等諸多作用，并為人們提供了休閑和娛樂場所。隨著草坪業(yè)的蓬勃發(fā)展，草坪的建植與養(yǎng)護管理也逐步走上科學化道路。而如何解決草坪草的凍枯問題，延長草坪草的綠期，增加草坪的景觀和使用價值，始終是我國草坪學領域的主要研究內容之一[1]。目前國內外提高草坪草抗寒性的途徑主要有冬季覆蓋[2-3]、抗寒鍛煉[4-6]、品種選育[7-8]、化學誘導[9]和施肥[10]。施肥是草坪養(yǎng)護管理體系中最經濟、最有效的手段之一。Voigt和Fermanian[11]對具有豐富的草坪教學和管理研究經驗的幾百名專家進行的調查表明，草坪施肥是改善草坪品質和維護草坪持久性的決定因素。目前通過施肥來延長草坪綠期的研究多集中在單施或配比施用氮、磷、鉀等無機肥和糞肥、堆肥等有機肥[12]，而將腐植酸肥料用于增強草坪草抗寒性的研究報道還較為少見。造紙黑液是植物纖維原料(如木材、麥草和稻草等)經堿法制漿蒸煮后所得的廢液，富含低分子量腐植酸和纖維素降解物以及木糖、氮、磷、鉀等物質。造紙黑液腐植酸和煤炭腐植酸在組成結構及對土壤和作物的影響等方面有類似之處。早在20世紀70年代研究造紙黑液腐植酸在農業(yè)生產中的應用，就引起了許多國家科技工作者的興趣[13]，而將造紙黑液噴施于草坪以延長草坪綠期的研究鮮見報道。

本試驗在秋季低溫來臨前分別對試驗區(qū)域草地早熟禾噴施清水、無機肥和造紙黑液。以實驗室生理生化指標測定和田間表觀性狀打分相結合的方法，跟蹤測定了草地早熟禾的電解質滲透率(EL)，超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)、葉綠素(Chl)、脯氨酸(Fpro)和可溶性糖(WSS)含量6個生理生化指標以及草坪蓋度、密度、質地、色澤、綠期和均一性6項表觀性狀，全面客觀地評價了不同處理對草地早熟禾抗寒保綠的作用效果，為進一步研究草坪草的抗寒性，延長草坪綠期提供科學依據。

1 材料與方法

1.1試驗地概況 試驗地位于北京市區(qū)的中國科學院過程工程研究所東區(qū)草坪，116°33′ E，39°99′ N,海拔46 m，屬暖溫帶大陸性季風氣候，年均溫11.6 ℃。試驗期間極端最高氣溫25.8 ℃，極端最低氣溫-10.4 ℃。試驗地土壤為淋溶褐土，質地為粘壤土，屬中性。土壤有機質含量14.90 g/kg，速效氮89.92 mg/kg，速效磷47.51 mg/kg，速效鉀22.13 mg/kg，pH值7.85。

2008年10月1日進行草地早熟禾田間抗寒試驗，記錄試驗期間每日氣溫(圖1)。北京10月日均氣溫在7～19 ℃，11月日均氣溫在1～12 ℃波動，12月日均氣溫銳減到零下并在-9～3 ℃波動。整個試驗期間北京日均氣溫有5次驟降，第1次是10月上旬由19 ℃大幅度降至11 ℃，第2次是10月下旬由17 ℃降至7 ℃，第3次是11月中旬由8 ℃降至1 ℃，第4次是12月上旬由4 ℃降至-7 ℃，第5次是12月中旬由1 ℃降至-9 ℃。

圖1 田間試驗期間北京日均氣溫

1.2試驗材料 草地早熟禾(Poapratensis)英文名Kentucky Bluegrass，別名六月禾，禾本科早熟禾屬多年生草本植物，是世界上利用最廣泛的冷季型草坪植物，適宜于公園、學校、庭院、街道等公共場所作為觀賞草坪。

試驗用無機肥為國產尿素(氮含量46%)，磷酸二銨(磷含量46%、氮含量16%)，氯化鉀(鉀含量60%)。

造紙黑液為亞銨黑液，由中國科學院過程工程研究所提供，其腐植酸含量為5.3%，氮含量為2.8%。

1.3試驗設計 試驗設空白對照、無機肥、造紙黑液3個處理。無機肥的施用量設定為尿素∶磷酸二銨∶氯化鉀為10∶15∶12 g/m2。造紙黑液的施用量為250 mL/m2，其中氮含量與無機肥中氮含量相當。每個施肥小區(qū)面積為2 m×4 m，各施肥小區(qū)之間有2 m寬的保護帶。

1.4抗寒性評價方法 采集草地早熟禾的葉片，每15 d檢測一次，直至空白對照小區(qū)草坪完全枯黃。參照鄒琦的方法[14]，EL的測定采用電導法，SOD活性的測定采用SOD抑制氮藍四唑(NBT)光化還原法，MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法，Chl含量的測定采用乙醇研磨提取法，F(xiàn)pro含量的測定采用磺基水楊酸提取法，WSS含量的測定采用蒽酮比色法。

1.5觀賞性評價方法 用目測法觀測各試驗小區(qū)草坪的蓋度、密度、質地、色澤、綠期和均一性6項性狀。試驗期間總共觀測3次，觀測日期分別為10月1日，11月1日和12月1日，均于16:00觀測，以防止露珠和陽光影響。觀測結果采用國際通用的草坪質量“9分制”方法評價，其中1分為最差，9分為最好，5分為可接受水平。最后將各小區(qū)草坪性狀進行加權評分，得分高者表示觀賞性好。

2 結果與分析

2.1不同處理對草地早熟禾的抗寒性影響 質膜是凍害的原初部位和主要部位[15]，低溫脅迫能引起植物細胞透性的明顯改變，導致溶質外滲。低溫條件下，EL與植物的抗寒性呈負相關。由圖2可知，降溫初期草地早熟禾得到抗寒鍛煉，植物體內的保護系統(tǒng)可逆性地緩解了低溫對膜系統(tǒng)的傷害，電解質滲透率下降。12月上旬氣溫驟降至零下，草地早熟禾受到冷凍傷害，組織胞間結冰，冰晶體積膨大直接破壞質膜結構，EL急劇上升，不同處理間葉片EL差異顯著(P<0.05)。造紙黑液處理葉片的EL增加相對緩慢，說明其受到的低溫傷害比無機肥處理小。

圖2 不同處理對草地早熟禾葉片電解質滲透率的影響

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同。

低溫環(huán)境下植物體內活性氧自由基積累，引起膜脂過氧化，導致植物冷凍害。SOD作為植物體內重要的保護酶，可清除活性氧自由基進而減輕對植物的傷害，因此成為評價植物抗寒性的重要指標[16]。由圖3可知，試驗期間不同處理下草地早熟禾葉片的SOD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在降溫初期，草地早熟禾得到抗寒鍛煉，其葉片SOD活性明顯提高。造紙黑液處理葉片SOD活性上升顯著(P<0.05)，最高達201.16 U/g。當氣溫降至零下時，SOD迅速失活。造紙黑液處理的SOD活性上升幅度顯著高于無機肥處理，表明造紙黑液能夠強化植物體抗寒鍛煉的效果，提高其抵御逆境的能力。

圖3 不同處理對草地早熟禾葉片超氧化物歧化酶活性的影響

MDA是植物遭受低溫逆境時，生物膜系統(tǒng)膜脂過氧化的最終產物，其濃度的高低代表膜脂過氧化強度及膜系統(tǒng)的傷害程度[17]。由圖4可知，降溫前期草地早熟禾葉片的MDA含量明顯下降，表明植物體膜系統(tǒng)膜脂過氧化程度減輕，植物抗寒性增強；當日均氣溫銳減至零下時，細胞受到嚴重傷害，MDA迅速大量累積。整個試驗期間不同處理間葉片MDA含量差異顯著(P<0.05)。由MDA變化趨勢可知造紙黑液處理的抗寒性最強，無機肥處理次之，對照草坪最弱。

圖4 不同處理對草地早熟禾葉片丙二醛含量的影響

Chl含量高，在一定條件下能夠提高光合作用能力，提供更多光合產物供植物體的生長和利用，因此可作為植物抗寒能力的生理指標。一般來說，Chl合成的最適溫度是30 ℃左右，最低溫度是3℃左右[18]。由圖5可知，進入10月以后，日均氣溫降為20 ℃以下，Chl合成速率隨之降低；12月上旬日均氣溫驟降為零下，阻礙Chl合成，草地早熟禾葉片的Chl含量急劇減少。無機肥處理葉片的Chl含量在低溫前期保持較高水平，但與其他處理差異不顯著(P>0.05)。造紙黑液處理的Chl含量在整個試驗期間呈緩慢下降趨勢，與其他處理差異顯著(P<0.05)。表明植物體在低溫脅迫下仍能保持一定的綠色，這與田間觀測結果一致。

圖5 不同處理對草地早熟禾葉片葉綠素含量的影響

Fpro是植物體內一種最有效的親和性滲透調節(jié)物質[19]，可以防止失水，增強蛋白質的水合作用，保護生物大分子結構和功能的穩(wěn)定。試驗期間不同處理葉片的Fpro含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。降溫前期無機肥處理的Fpro含量上升最快，且與其他處理差異顯著(P<0.05)，最大值達到868.95 μg/g，顯示出較好的抗寒能力。降溫后期造紙黑液處理的Fpro含量下降最緩慢，且與其他處理差異顯著(P<0.05)，表明受到的冷凍傷害最輕(圖6)。

圖6 不同處理對草地早熟禾葉片脯氨酸含量的影響

WSS可提高細胞液的濃度，增加細胞持水能力，從而降低細胞質的冰點[20]。植物在逆境下會主動積累WSS以適應外界環(huán)境的變化。施用造紙黑液和無機肥均可使草地早熟禾葉片的WSS含量達到較高水平，對植物體起到較好的保護作用。造紙黑液處理葉片WSS含量最高為137.15 μg/g，與其他處理差異顯著(P<0.05)。受到冰凍傷害后，無機肥處理葉片的WSS含量急劇減少，植物體抵御傷害的能力隨之下降，而造紙黑液處理葉片的變化相對緩和，表明其抗寒能力較強(圖7)。

2.2不同處理對草地早熟禾的觀賞性影響 自然降溫過程草地早熟禾觀賞性評定指標的觀測結果見表1。隨著北京日均氣溫逐漸降低，草坪草受到愈加嚴重的低溫傷害，各項表觀性狀明顯下降。植物體于11月中旬開始干枯、死亡，草坪出現(xiàn)較為明顯的裸露地面。由表中可以看出，造紙黑液處理的草坪蓋度、質地、綠期和均一性均優(yōu)于無機肥處理，密度與無機肥處理未見明顯差異，而色澤與對照接近，比無機肥處理稍差。田間觀測發(fā)現(xiàn)，經歷了4次氣溫驟降后，對照區(qū)域草坪在12月中旬達到半數枯黃，于1月上旬完全枯黃，12月中旬日均氣溫再次銳減。

圖7 不同處理對草地早熟禾葉片可溶性糖含量的影響

處理蓋度密度質地色澤綠期均一性對照 657856無機肥 787967造紙黑液888889

注：除綠期是根據保綠天數一次性打分外，其余5項表觀性狀的打分均是3次田間觀測的平均值。

無機肥處理區(qū)域草坪迅速進入枯黃期，在1月中旬完全枯黃，較對照草坪綠期延長10 d左右；造紙黑液處理區(qū)域草坪在1月下旬進入枯黃期，較對照延長綠期40 d左右。

為了對草地早熟禾的觀賞性品質有一個綜合的評價，對自然降溫過程草地早熟禾的各項性狀觀測結果進行加權和評分，得出蓋度、密度、質地、色澤、綠期和均一性的權重分別為0.10、0.10、0.20、0.15、0.25和0.20，加權平均分越高則表示該小區(qū)草坪的觀賞性越好。

列出模糊關系陣，求得綜合評定Y：

W=(0.10,0.10,0.20,0.15,0.25,0.20)

Y=W

R=(6.15，7.15，8.20)

對照的觀賞性得分是6.15，無機肥處理的得分是7.40，造紙黑液處理的得分最高，為8.20，說明在秋冬季節(jié)低溫脅迫下，對照草坪的各項表觀品質迅速下降，噴施無機肥和造紙黑液都能不同程度地減緩這種趨勢。造紙黑液處理的草坪保持了較高的觀賞性，表明植物體抵御低溫的能力得到了明顯提高。

3 討論與結論

3.1膜系統(tǒng) 正常情況下，植物體內活性氧自由基不斷產生，同時不斷被超氧化物歧化酶清除，二者處于動態(tài)平衡狀態(tài)。逆境時活性氧累積過多，引起膜脂過氧化，產生大量膜脂過氧化產物丙二醛，導致膜相變和膜結構破壞，電解質滲透率隨之上升[18]。10月的2次氣溫驟降使草地早熟禾得到抗寒鍛煉，尤其是造紙黑液處理，其葉片超氧化物歧化酶活性顯著提高，顯示了較好的抗寒能力。超氧化物歧化酶清除細胞內自由基，保護膜系統(tǒng)，使丙二醛降至較低水平。進入12月后氣溫降至零下，植物受到了冰凍傷害，超氧化物歧化酶迅速失活，丙二醛大量累積，同時質膜受到冰晶機械損傷，產生不可逆的嚴重傷害，電解質滲透率迅速上升。結果表明，相對于無機肥，造紙黑液更為顯著地提高了草地早熟禾抗寒鍛煉的效果，減緩了冷凍對膜系統(tǒng)造成的傷害。

3.2調節(jié)滲透物質 脯氨酸和可溶性糖都是植物體內重要的滲透調節(jié)物質，低溫脅迫下脯氨酸和可溶性糖都會大量累積以適應逆境[21]。無機肥提供了葉綠素生物合成所必需的氮元素，使得葉綠素在低溫前期保持較高水平， 因而光合作用較強，脯氨酸和可溶性糖含量明顯高于造紙黑液處理。隨著氣溫進一步降低，植物體把在葉片合成的脯氨酸和可溶性糖轉移至根部以抵御冷凍脅迫[22]。無機肥中的鉀、磷等參與糖類的轉化和運輸，使無機肥處理葉片的脯氨酸和可溶性糖迅速轉移至地下，提高了根部的抗寒性。而本試驗顯示，造紙黑液處理葉片的脯氨酸和可溶性糖含量減少相對緩慢，保持了地上部分較好的抗寒性。

3.3觀賞性 在田間自然降溫過程中，造紙黑液處理區(qū)域的草地早熟禾保持了較好的觀賞性。其中草坪蓋度、質地、綠期和均一性均優(yōu)于無機肥處理，密度與無機肥處理未見明顯差異，而色澤比無機肥處理稍差。這可能是因為無機肥中的氮能被植物體快速吸收，促進葉綠素合成，而造紙黑液中的氮受到腐植酸的緩釋作用，雖然短期效果不如無機肥顯著，但延長了肥效，其處理區(qū)域草坪的綠期比無機肥處理草坪長。

3.4綠期 綠期是指草坪草一年中保持綠色的天數，通常統(tǒng)計從草坪返青達1/2到草坪枯黃達1/2期間的天數。北京地區(qū)草地早熟禾的綠期為290 d左右，一般12月下旬枯黃，3月中下旬返青。本試驗表明，噴施無機肥的草坪綠期較對照延長約10 d，噴施造紙黑液的草坪綠期延長約40 d。值得注意的是，造紙黑液處理區(qū)域草坪一直保持半數枯黃狀態(tài)直至3月上旬提前返青。造紙黑液對草地早熟禾返青的影響有待進一步研究。

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ComparisonofeffectsofpulpingblackliquorandinorganicfertilizerapplicationonthecoldresistanceofPoapratensis

WEN Qiu-ming1,2,MO Hai-tao1,ZHANG Xiao-yong1

(1.National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China; 2.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The physiological and biochemical indexes and apparent quality of leaves were trace-determined in autumn to compare the effects of pulping black liquor and inorganic fertilizer application on the cold resistance ofPoapratensis. The results of this study showed that the pulping black liquor and inorganic fertilizer enhanced the cold hardening effect ofP.pratensisto some degrees. The inorganic fertilizer increased the accumulation of free proline with a maximum concentration of 868.95 μg/g, while the pulping black liquor increased the activity of superoxide dismutase (SOD) with 201.16 U/g and the content of soluble sugar (WSS) with 137.15 μg/g. The inorganic fertilizer prolonged the turf green period for about 10 days, while the pulping black liquor did it for about 40 days. The pulping black liquor enhanced the cold resistance ofP.pratensismore effectively and maintained a higher apparent quality.

Poapratensis; physiological and biochemical indexes; pulping black liquor; cold resistance; cold hardening

S543.034；S141.8

A

1001-0629(2011)01-0047-06

2010-03-23 接受日期：2010-05-20

中國科學院農業(yè)創(chuàng)新項目(KSCX2-YW-N-41-04)

文秋明(1984-)，女，廣西桂林人，在讀碩士生，研究方向為農業(yè)生化工程。

E-mail:qmwen@home.ipe.ac.cn

張小勇 E-mail:xyzhang@home.ipe.ac.cn