杜氏鹽藻高鹽誘導(dǎo)蛋白的分離和鑒定＊

柴玉榮,劉國紅,崔柳青,劉紅濤,李 杰,薛樂勛#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001 #通訊作者,男,1944年 2月生,研究員,研究方向:腫瘤與生物工程,E-mail:xuelx@371.net

杜氏鹽藻高鹽誘導(dǎo)蛋白的分離和鑒定＊

柴玉榮1),劉國紅1),崔柳青2),劉紅濤2),李 杰2),薛樂勛2)#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001 #通訊作者,男,1944年 2月生,研究員,研究方向:腫瘤與生物工程,E-mail:xuelx@371.net

杜氏鹽藻;雙向電泳;質(zhì)譜;高鹽

目的:對高鹽和低鹽培養(yǎng)條件下杜氏鹽藻蛋白質(zhì)組的雙向電泳 (2-DE)圖譜進(jìn)行比較分析,篩選高鹽誘導(dǎo)蛋白并鑒定。方法:提取高鹽 (3.5 mol/L NaCl)和低鹽 (1.5 mol/L NaCl)培養(yǎng)條件下杜氏鹽藻的總蛋白并進(jìn)行2-DE,考馬斯亮藍(lán)染色后用 I mage-Scanner掃描儀掃描,I mageMaster 5.0圖像分析軟件分析,并利用基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜法 (MALD I-TOF)對在高鹽培養(yǎng)條件下增強(qiáng)表達(dá)達(dá)到 3倍的蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果:2-DE圖譜上共分離出 509個杜氏鹽藻蛋白質(zhì)斑點(diǎn),主要分布在等電點(diǎn) 4～8和相對分子質(zhì)量 20 000～97 000的范圍內(nèi);高鹽培養(yǎng)條件下有 21個蛋白增強(qiáng)表達(dá)達(dá)到 3倍并且通過MALD I-TOF鑒定出了其中的 12個。結(jié)論:成功獲得了分辨率和重復(fù)性較好的杜氏鹽藻蛋白質(zhì)組 2-DE圖譜,鑒定得到了 12種高鹽誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)達(dá)到 3倍的蛋白。

近年來,人們對生物耐鹽機(jī)制有了深入的認(rèn)識,但植物的整個耐鹽體系及耐鹽機(jī)制仍不清楚[1-2]。杜氏鹽藻 (Dunaliella salina,D.salina)是一種沒有細(xì)胞壁的單細(xì)胞真核綠藻,其突出優(yōu)點(diǎn)在于光合自養(yǎng)、培養(yǎng)條件簡單且抗逆性極佳,能在NaCl濃度很高甚至飽和的環(huán)境中生長繁殖[3]。目前,以鹽藻作為研究植物耐鹽機(jī)制的模式生物已取得了一些成果[4-5]。王曉慶等[6]用第二向垂直電泳 (SDS-PAGE)的方法發(fā)現(xiàn)鹽藻中相對分子質(zhì)量為 51 000和 23 000的蛋白可能與其耐鹽機(jī)制有關(guān)。作者采用蛋白質(zhì)雙向電泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技術(shù)分離低鹽和高鹽培養(yǎng)條件下D.salina的總蛋白,獲得差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜,并對明顯增強(qiáng)表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行了鑒定,以期為進(jìn)一步克隆鑒定特異的鹽藻耐鹽基因及最終闡明高等植物的耐鹽機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 24 cm線性 pH 3～10固相 pH梯度 (immobilized pH gradients,IPG)膠條,Ettan IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALTsix電泳儀、I mage-Scanner圖像掃描儀、I mageMaster 5.0凝膠圖像分析軟件及標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)志物為 GE公司產(chǎn)品;pH 3～10兩性電解質(zhì)、尿素及硫脲為Bio-Rad公司產(chǎn)品;3-[3-(膽酰胺基丙基)二甲氨基 ]丙磺酸鹽 (CHAPS)、蛋白酶抑制劑、Triton-X 100、二硫蘇糖醇 (DTT)、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、小牛血清白蛋白均為 Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 D.salina細(xì)胞的培養(yǎng)與分組D.salina購自美國德州大學(xué),采用改良的 PKS液體培養(yǎng)基[7],培養(yǎng)條件為:26℃,光照強(qiáng)度 4 500 Lux,12 h光照,12 h暗培養(yǎng)。分別取在高鹽 (3.5 mol/L NaCl)和低鹽(1.5 mol/L NaCl)條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期的鹽藻細(xì)胞,經(jīng) 2000 r/min離心 5 min后富集。

1.3 D.salina細(xì)胞總蛋白的提取 加入裂解緩沖液(6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.02 mol/L DTT、20 g/L CHAPS、體積分?jǐn)?shù) 0.2%兩性電解質(zhì)、體積分?jǐn)?shù)1%Triton-X 100及蛋白酶抑制劑)混勻后超聲破碎,三氯醋酸-丙酮沉淀法過夜。蛋白沉淀后用上樣緩沖液(6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.02 mol/L DTT、20 g/L CHAPS、體積分?jǐn)?shù) 0.2%兩性電解質(zhì)和體積分?jǐn)?shù) 0.05%IPGBuffer)復(fù)溶,采用BradFord法測定蛋白濃度。

1.4 第一向等電聚焦電泳(IEF) 用 24 cm線性pH 3～10 IPG膠條,蛋白樣品上樣量均為 400μg,用 IPGphor等電聚焦系統(tǒng)進(jìn)行 IEF。程序如下:30 V,12 h;200 V,1 h;500 V,1 h;1 000 V,1 h;線性梯度從 1 000 V升至 8 000 V;8 000 V,10 h,限制電流為50μA/膠條。

1.5 SDS-PAGE 將聚焦后的膠條在 SDS平衡液

(1.5 mol/L Tris-Cl,pH 8.8;50 mmol/L體積分?jǐn)?shù)30%甘油;6 mol/L尿素;20 g/L SDS)中平衡 2次,搖床上振蕩 15 min/次,其中第 1次平衡液中加入 20 mmol/L DTT,第 2次平衡液中加入 100 mmol/L碘乙酰胺。取出膠條在 Ettan DALTsix上進(jìn)行垂直 SDSPAGE,用 125 g/L的聚丙烯酰胺凝膠分離,40 mA 40 min,60 mA 5 h,直至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)玻璃板底部。

1.6 圖像分析 凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色及脫色后,用 I mage-Scanner掃描儀掃描 2-DE圖像,I mageMaster 5.0軟件進(jìn)行圖像分析。高鹽培養(yǎng)和低鹽培養(yǎng)得到的 2塊蛋白膠,通過蛋白斑點(diǎn)檢測和匹配分析,選定在高鹽條件下鹽藻蛋白增強(qiáng)表達(dá)達(dá)到 3倍以上的斑點(diǎn)。

1.7 差異表達(dá)蛋白的鑒定 將選定的斑點(diǎn)從 2-DE凝膠上切下,胰蛋白酶消化后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜法(MALD I-TOF)分析,利用肽指紋圖譜比對程序?qū)⑺觅|(zhì)譜數(shù)據(jù)信息在NCB I植物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析,篩選出比對結(jié)果達(dá)到預(yù)期肽指紋圖譜比對程度分值要求的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 D.salina總蛋白 2-DE考馬斯亮藍(lán)染色圖譜高鹽和低鹽培養(yǎng)條件下鹽藻總蛋白的 2-DE圖譜(圖 1)斑點(diǎn)清晰,重復(fù)性好,主要分布在等電點(diǎn) (p I) 4～8和相對分子質(zhì)量 20 000～97 000范圍內(nèi)。2塊膠中匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)為 509個,從中篩選出高鹽下蛋白增強(qiáng)表達(dá)達(dá)到3倍的蛋白點(diǎn)共 21個。

2.2 高鹽培養(yǎng)條件下增強(qiáng)表達(dá)蛋白的鑒定 所篩選的 21個蛋白經(jīng)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫比對,其中 9個蛋白未找到有效匹配結(jié)果;其余12個蛋白均獲得有效匹配結(jié)果,得以鑒定,其中 2個暫未命名,余 10個鑒定結(jié)果見表 1。

圖 1 高鹽(A)和低鹽(B)培養(yǎng)條件下的D.salina總蛋白的 2-DE圖譜

表1 鑒定的2-DE圖譜中的高鹽誘導(dǎo)蛋白

3 討論

近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于從生物整體水平分析樣本間蛋白表達(dá)的差異,它具有高通量的特點(diǎn)[8]。2-DE技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分離蛋白質(zhì)的核心方法,利用 2-DE技術(shù)分離不同樣本的總蛋白,可獲得分辨率高且重復(fù)性好的 2-DE圖譜,這是篩選鑒定差異表達(dá)蛋白的基礎(chǔ)。該實(shí)驗(yàn)中所獲得的低鹽和高鹽培養(yǎng)條件下鹽藻總蛋白的2-DE圖譜分辨率高,蛋白斑點(diǎn)清晰均勻,且重復(fù)性好,為后續(xù)的分析和鑒定提供了可靠基礎(chǔ)。

盡管數(shù)據(jù)庫中鹽藻的基因組序列和蛋白質(zhì)組序列非常有限,蛋白質(zhì)組學(xué)分析仍然是一種非常有效的檢測和鑒定鹽藻中差異蛋白質(zhì)表達(dá)的方法[3-4]。該研究中,盡管高鹽培養(yǎng)條件下D.salina總蛋白 2-DE圖譜中出現(xiàn)了一些低鹽培養(yǎng)條件下圖譜中未顯現(xiàn)的特異蛋白斑點(diǎn),但考慮到假陽性的可能性,所以只選擇了高鹽培養(yǎng)條件下增強(qiáng)表達(dá)并且蛋白表達(dá)量達(dá)到3倍或以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)作為進(jìn)一步鑒定的對象。所選擇的 21個蛋白點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜分析后有 9個未能找到有效數(shù)據(jù)匹配,但比對的結(jié)果仍然提供了可靠的部分氨基酸序列,這些氨基酸序列為進(jìn)一步對這些蛋白基因進(jìn)行深入研究提供了依據(jù)。

高鹽脅迫適應(yīng)過程是一個復(fù)雜的相互作用的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),需要大量基因協(xié)同作用。該研究中所鑒定出的高鹽誘導(dǎo)蛋白均和高鹽脅迫條件下的生物個體的生理反應(yīng)相關(guān)[9-10],例如鐵-超氧化物歧化酶能夠清除活性氧,鈣依賴性蛋白激酶和 G蛋白參與了細(xì)胞膜上的信號傳導(dǎo),30S核糖體蛋白 S4與鹽脅迫下增強(qiáng)光合作用有關(guān),ATP合成酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶和乙醇脫氫酶均與能量代謝和葡萄糖代謝相關(guān),動力蛋白 1-α重鏈極有可能與鹽脅迫下鹽藻鞭毛的運(yùn)動相關(guān)。

綜上所述,作者采用 2-DE成功分離和比較了D.salina低鹽和高鹽培養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì),質(zhì)譜分析所鑒定的鹽誘導(dǎo)相關(guān)蛋白為進(jìn)一步探索其耐鹽機(jī)制以及利用這些鹽誘導(dǎo)相關(guān)蛋白來改善其他物種的耐鹽性提供了依據(jù)。

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Isolation and identification of high concentration salt-induced proteins fromDunaliella salina

CHA I Yurong1),L IU Guohong1),CU I L iuqing2),L IU Hongtao2),LI Jie2),XUE Lexun2)1)Departm ent of Histology and Em bryology,College of Basic M edical Sciences,Zhengzhou University, Zhengzhou 4500012)Laboratory for Cell B iology,Departm ent of B ioengineering,Zhengzhou University, Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;two-dimensional electrophoresis;mass spectrum;high concentration salt

Ai m:To analyze the two-dimensional electrophoresis(2-DE)maps ofDunaliella salina(D.salina)under differentNa+concentration(3.5 mol/L NaCl and 1.5 mol/L NaCl)and screen differently expressed proteins between them.Methods:2-DE was taken to separate the total proteins fromD.salinatreated with high and low concentration salt. Protein patterns were analyzed and identified by I mageMaster 5.0 software and MALD I-TOF after staining and scanning. Results:A total of 509 protein spotswere found as differently expressed proteins,out of which,the expression level of 21 proteins cultured in high concentration salt condition was three times of those cultured in low concentration salt condition. Conclusion:2-DE profiles fromD.salinawith high resolution and reproducibility have been obtained and 12 up-regulated proteins in high salt concentration have been identified.

Q786

＊國家自然科學(xué)基金資助項目 30540067

(2010-01-07收稿 責(zé)任編輯徐春燕)