高效液相色譜法測定納豆及納豆膠囊中的大豆異黃酮含量

張 巖， 王莉娜

(北京燕京啤酒集團公司技術(shù)中心，北京 101300)

高效液相色譜法測定納豆及納豆膠囊中的大豆異黃酮含量

張 巖， 王莉娜

(北京燕京啤酒集團公司技術(shù)中心，北京 101300)

建立了納豆及納豆膠囊中大豆異黃酮的高效液相色譜分析方法，該方法重復(fù)性及樣品穩(wěn)定性良好.實驗對原料黃豆、納豆和納豆膠囊樣品采用石油醚索氏脫脂后，對固體樣品進行乙醇回流提取，分析了4種大豆異黃酮組分，即大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素.結(jié)果表明，原料黃豆總異黃酮質(zhì)量比為1 260 mg/kg，納豆比原料黃豆總異黃酮含量明顯高約30%，納豆膠囊比原料黃豆總異黃酮含量高約11%.

納豆;納豆膠囊;大豆異黃酮;液相色譜法

納豆是一種大豆發(fā)酵食品，它是將黃豆洗凈、蒸煮后，加入納豆菌，包裝成型，在固定的溫度和濕度下發(fā)酵，再放入4℃以下后熟一定時間制成.新鮮的納豆色澤金黃、口感酥軟，用筷子挑起時有很長的拉絲樣粘液物質(zhì)，這種粘液物質(zhì)是果聚糖的混合物.納豆膠囊是將凍干后的納豆經(jīng)過適當(dāng)處理，加入一些添加物混合而成，之后做成膠囊.納豆作為一種功能性保健食品，具有溶血栓、抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗氧化性、防止骨質(zhì)疏松、促凝血等對人體較高的生理功能及營養(yǎng)保健作用，正在被越來越多的消費者所關(guān)注.目前，國內(nèi)外對于納豆激酶研究已深入到分子生物學(xué)水平，對納豆激酶溶栓通栓作用機理也研究得較為深入.國內(nèi)對納豆的研究集中在納豆激酶，對于納豆中其他活性成分或抗?fàn)I養(yǎng)因子以及某些藥理作用研究報道較少.

納豆的原料是黃豆，而黃豆本身含有豐富的大豆異黃酮(soybean isoflavones，ISO)，因此大豆異黃酮也存在于納豆及納豆膠囊中.大豆異黃酮是納豆和納豆膠囊中富含的功能性有效成分的一種，是一類芳香族化合物，對溫度比較穩(wěn)定，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等極性溶劑，難溶于水.大豆異黃酮屬于黃酮類化合物，分為游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷兩類，其中包括12種組分，本研究僅對其中的大豆苷(daidzin)、染料木苷(genistin)、大豆素(daidzein)和染料木素(genistein)4種大豆異黃酮進行研究［1］.

對于大豆異黃酮的檢測，國內(nèi)外采用的定量分析方法有:比色法、薄層法、氣相色譜法及液相色譜法，經(jīng)比較，液相色譜法速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好、變異系數(shù)低，比較適用于工業(yè)分析［2］.大豆異黃酮的提取，文獻中報道主要集中在超聲法和索氏提取法，研究發(fā)現(xiàn)，超聲法對樣品中大豆異黃酮的提取不完全，造成液相色譜分析含量偏低，本實驗所采用提取方法為索氏提取，先對樣品進行脫脂，之后回流提?。?－6］.本實驗對納豆及納豆制品中大豆異黃酮含量測定的液相色譜法進行了研究，并對樣品的預(yù)處理方法進行了比較，希望為納豆產(chǎn)品的進一步研究及工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品檢測打好基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品和試劑

原料黃豆、納豆及納豆膠囊由燕京中發(fā)生物技術(shù)有限公司提供.

大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品大豆苷(daidzin)、染料木苷(genistin)、大豆素(daidzein)和染料木素(genistein)購于Sigma試劑公司.乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、磷酸(85%分析純)、二甲亞砜(色譜純)均為市售.

1.2 儀器和設(shè)備

1100型高效液相色譜儀(配紫外檢測器)，美國安捷倫科技公司;SoxtecTM2055型索氏脂肪分析儀，F(xiàn)OSS公司;KQ-500DE型超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器有限公司;分析天平(0.01 mg感量)、酸度計、離心機、流動相過濾裝置、容量瓶(10 mL).

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制

分別稱取大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素5 mg(精確至0.01 mg)置于10 mL容量瓶中，加入二甲亞砜至接近刻度，超聲處理30 min至樣品溶解完全，再用二甲亞砜定容.

1.4 混標(biāo)溶液配制

吸取大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素四種標(biāo)準(zhǔn)儲備液各0.2 mL于10 mL容量瓶中，加入等體積水，用體積分?jǐn)?shù)為50%二甲亞砜水溶液定容，混勻備用.

1.5 樣品預(yù)處理

a.超聲20 min(常溫):固體樣品粉碎、磨細(xì)，過80目篩，混勻，稱取0.05～0.5 g(精確至0.1 mg)，用體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇溶解并轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，加80%甲醇至接近刻度.利用超聲處理20 min，用80%甲醇定容，搖勻.取樣品溶液30 mL置于離心管中，離心15 min(轉(zhuǎn)速8 000 r/min).取上清液濾膜過濾，收集濾液備用.

b.超聲40 min(常溫):處理方法同a，僅超聲時間延長至40 min.

c.超聲20 min(60℃):處理方法同a，僅超聲溫度控制在60℃.

d.搖床處理30 min(常溫):固體樣品粉碎、磨細(xì)，過80目篩，混勻，稱取0.05～0.5 g(精確至0.1 mg)，用50 mL 80%甲醇溶解并轉(zhuǎn)至三角瓶中，經(jīng)搖床處理30 min，取樣品溶液30 mL置于離心管中，離心15 min(轉(zhuǎn)速8 000 r/min).取上清液濾膜過濾，收集濾液備用.

e.索氏提取-回流-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-回容:固體樣品粉碎、磨細(xì)，過80目篩，混勻，稱取6 g(精確至0.1 mg)，經(jīng)過索氏提取150 min脫脂后，將剩余固體樣品烘干加入圓底燒瓶，加入75 mL 80%乙醇，回流3 h，回流兩次，合并濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙醇，回容至50 mL色譜級甲醇，備用.

f.索氏提取-回流:固體樣品粉碎、磨細(xì)，過80目篩，混勻，稱取6 g(精確至0.1 mg)，經(jīng)過索氏提取150 min脫脂后，將剩余固體樣品烘干加入圓底燒瓶，加入75 mL 80%乙醇，回流3 h，回流兩次，合并濾液，取樣品溶液30 mL置于離心管中，離心15 min(轉(zhuǎn)速8 000 r/min).取上清液濾膜過濾，收集濾液備用.

1.6 色譜條件

色譜柱:Gemini 5 μ C18110A Phenomenex，250 mm × 4.6 mm，i.d.;流速:1.0 mL/min;波長:260 nm;進樣量:10 μL;柱溫:30℃ ;梯度洗脫程序如表1.

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

大豆異黃酮屬黃酮類化合物，經(jīng)紫外掃描，發(fā)現(xiàn)260 nm為最佳檢測波長.關(guān)于大豆異黃酮的梯度洗脫的確定，文獻中已有大量報道，本研究參考了文獻［7］的測定方法.大豆異黃酮混合標(biāo)樣與樣品液相色譜檢測結(jié)果見圖1.

2.2 預(yù)處理方法對大豆異黃酮液相色譜分析的影響

實驗采用超聲、搖床震蕩及索氏提取等不同方法對同一批次納豆膠囊樣品進行預(yù)處理，具體結(jié)果見表2.

由表2可以看出:

1)對于超聲法，超聲時間的延長和超聲溫度的增加對結(jié)果影響不大;

圖1 大豆異黃酮混合標(biāo)樣(a)與樣品(b)液相色譜比較結(jié)果Fig.1 HPLC of mixing standards of soybean isoflavone and samples

表2 不同預(yù)處理方法對納豆膠囊中大豆異黃酮液相色譜分析結(jié)果Tab.2 Effect of different pretreatment on the soybean isoflavone content in natto capsule by HPLC mg/kg

2)搖床震蕩提取法與超聲法比較，大豆苷和染料木苷有所提高，但大豆素和染料木素有所下降;

3)方法e和f比較，由于方法f未經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和回容，結(jié)果比方法e有所提高;

4)實驗需要對樣品進行脫脂后分析，研究發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)過脫脂對含量分析有一定影響，脫脂處理后比不脫脂處理大豆異黃酮含量有明顯升高，黃豆及納豆本身為豆類食品，自身含有大量的油脂，這可能在萃取時對黃酮類化合物產(chǎn)生了一定的保護作用，使得大豆異黃酮不容易被萃取完全.

因此，本實驗選擇方法f為預(yù)處理方法.

2.3 分析方法學(xué)研究

2.3.1 儀器精密度實驗

取同一樣品連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定大豆異黃酮各組分保留時間和峰面積，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD值均小于3%，表明儀器的精密度良好.

2.3.2 方法重復(fù)性實驗

精密稱取同一批次樣品6份，按相同的預(yù)處理方法進行制備，經(jīng)同樣的色譜條件進樣分析，測定保留時間和峰面積，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD值均小于5%，表明方法重復(fù)性良好.

2.3.3 樣品穩(wěn)定性實驗

取同一份樣品分別在一天的不同的時間(0，6，12，18，24 h)進樣，計算大豆異黃酮各組分含量，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD值均小于2.5%，表明樣品穩(wěn)定性良好.

2.4 大豆異黃酮在黃豆、納豆及納豆膠囊中的分析結(jié)果與比較

經(jīng)液相色譜分析，黃豆、納豆和納豆膠囊的大豆異黃酮含量如表3，分析結(jié)果如圖2.

表3 大豆異黃酮在黃豆中液相色譜分析結(jié)果Tab.3 Soybean isoflavone content of soybeans，natto，and natto capsule by HPLC mg/kg

圖2 黃豆、納豆及納豆膠囊中大豆異黃酮含量分析結(jié)果Fig.2 Soybean isoflavone content of soybeans，natto，and natto capsule

2.4.1 原料黃豆與市售普通黃豆比較

由表3和圖2可以看出，不同品種黃豆的大豆異黃酮含量的差別，原料黃豆比市售普通黃豆各大豆異黃酮組分普遍偏高;市售普通黃豆因品種差異，各組分各有不同，大豆素和染料木素質(zhì)量比為5～9 mg/kg，比原料黃豆低一個數(shù)量級.

2.4.2 納豆與原料黃豆比較

由表3和圖2可以看出，納豆與原料黃豆相比，大豆苷質(zhì)量比高約80～180 mg/kg;染料木苷質(zhì)量比為高約0～80 mg/kg;大豆素質(zhì)量比高約40～60 mg/kg;染料木素質(zhì)量比高約90～100 mg/kg.

2.4.3 納豆膠囊與原料黃豆比較

由表3和圖2可以看出，納豆膠囊中的大豆苷質(zhì)量比為560～660 mg/kg，染料木苷質(zhì)量比為630～700 mg/kg，大豆素質(zhì)量比為50～100 mg/kg，染料木素質(zhì)量比為50～110 mg/kg.與原料黃豆相比，大豆苷質(zhì)量比高約0～100 mg/kg，染料木苷質(zhì)量比相差不多，大豆素質(zhì)量比高約20～50 mg/kg，染料木素質(zhì)量比高約60～80 mg/kg.

3 結(jié)論

1)建立了納豆及納豆膠囊中大豆異黃酮的高效液相色譜測定方法.該方法采用 Gemini 5 μ C18110A Phenomenex(250 mm ×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱，以乙腈和磷酸-水(pH=3.0)作為流動相梯度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為30℃，進樣量為10 μL，檢測波長為 260 nm.該方法精密度、重復(fù)性及樣品穩(wěn)定性良好.

2)比較了不同的預(yù)處理方法對納豆膠囊大豆異黃酮分析的影響，結(jié)果顯示樣品預(yù)處理方法通過索氏提取對納豆膠囊樣品脫脂150 min后，將剩余固體樣品烘干加入圓底燒瓶，加入75 mL 80%乙醇，回流3 h，回流兩次，合并濾液，離心后，取清液直接進樣分析最佳.

3)比較了原料黃豆、市售普通黃豆、納豆和納豆膠囊中大豆異黃酮的質(zhì)量比，結(jié)果表明，原料黃豆比市售普通黃豆各大豆異黃酮組分普遍偏高，原料黃豆總異黃酮含量為1 260 mg/kg，納豆比原料黃豆總異黃酮含量明顯高200～400 mg/kg，納豆膠囊比原料黃豆總異黃酮含量高50～260 mg/kg.

［1］夏劍秋，劉宇峰.國內(nèi)外大豆異黃酮的研發(fā)及生產(chǎn)動態(tài)［J］.中國油脂，2002(5):10-12.

［2］高榮海，李長彪，孟憲長，等.大豆異黃酮分離機檢測方法的研究進展［J］.中國調(diào)味品，2006(7):4-8.

［3］謝明杰，宋明，鄒翠霞，等.超聲波提取大豆異黃酮［J］.大豆科學(xué)，2004(1):74-75.

［4］王松，丁立，周榮琪.HPLC法測定豆粕中大豆異黃酮含量［J］.化工進展，2005(2):196-199.

［5］段智變，董改香，溫曉慶，等.納豆及其提取物生物活性物質(zhì)測定［J］.山西工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008(2):180-183.

［6］宋冰，李鵬月，王丕武，等.大豆異黃酮的品種間差異分析［J］.大豆科學(xué)，2008，27(4):80-83.

［7］GB/T23788—2009.保健食品中大豆異黃酮的測定方法高效液相色譜法［S］.

(責(zé)任編輯:葉紅波)

Determination of Soybean Isoflavones in Natto and Natto Capsule by HPLC

ZHANG Yan，WANG Li-na
(Technology centre，Beijing yanjing beer group corp，Beijing 101300，China)

A high performance liquid chromatographic method was developed for the determination of soybean isoflavones in Natto and Natto Capsule，and the method showed good repeatability and sample stability.Soybean isoflavone were extracted from defatted soybean，Natto and Natto capsule by heating circumfluence method.Four kinds of soybean isoflavone including daidzin，genistin，daidzein and genistein were determined.The results showed that the soybean isoflavones in Natto were 1260 mg/kg，which were 30%higher than that in soybean，and the soybean isoflavones in Natto capsule were 11%higher than that in soybean.

natto;natto capsule;soybean isoflavones;high performance liquid chromatography

TS214

A

1671-1513(2011)01-0038-04

2010-12-01

張 巖，男，碩士，研究方向為液相色譜檢測技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用;

王莉娜，女，北京燕京啤酒集團技術(shù)中心副主任，高級工程師，主要從事色譜技術(shù)在啤酒風(fēng)味質(zhì)量研究中的應(yīng)用研究.