相麗新, 楊道興, 魏彥梅, 顏丙霞
(濟寧耐特食品有限公司,山東濟寧 272075)
雞精中呈味核苷酸二鈉的高效液相色譜法測定
相麗新, 楊道興, 魏彥梅, 顏丙霞
(濟寧耐特食品有限公司,山東濟寧 272075)
建立了高效液相色譜法測定呈味核苷酸二鈉(IMP和GMP)含量的方法.以四丁基磷酸銨和磷酸二氫鉀配以一定比例的乙腈為流動相,采用高耐水系Waters RP 18色譜柱,通過色譜條件的優(yōu)化,獲得了定性定量重復(fù)性相對標準偏差<2%的標準品色譜圖,其中,IMP標準曲線在60~600 μg/mL范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)為R=1.0000,GMP標準曲線在50~480 μg/mL范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)為R=0.999 9.測得某品牌的雞精內(nèi)IMP質(zhì)量含量為0.54%,GMP質(zhì)量含量為0.60%,兩次測定結(jié)果的精密度GMP為0.73%,IMP為1.17%.
高效液相色譜;呈味核苷酸二鈉;定性定量重復(fù)性;相對標準偏差;雞精
呈味核苷酸二鈉(IMP和GMP)一般是以淀粉為原料,經(jīng)發(fā)酵法或酶解法制得的混合物,具有較強的增鮮作用,被廣泛應(yīng)用于各類食品中[1-3].目前國內(nèi)的IMP和GMP含量檢測方法主要是紫外分光光度法[3],此法在樣品中含大量蛋白及其他核酸時,會造成檢測結(jié)果與實際值偏差較大.采用高效液相色譜法,利用液液反復(fù)分配,并通過色譜條件的優(yōu)化選擇,可將幾種核苷酸完全分離,同時獲得定性定量重復(fù)性相對標準偏差<2%的呈味核苷酸二鈉中的5'-肌苷酸二鈉(disodium 5'-inosinate,IMP)和5'-鳥苷酸二鈉(disodium 5'-guanylate,GMP)的標準樣品色譜圖,本實驗通過對雞精進行必要的前處理,獲得了雞精中呈味核苷酸二鈉的含量.與滴定法相比,高效液相色譜法的定量測定結(jié)果具有更高的重現(xiàn)性,該方法也可為香料生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持.
甲醇、乙腈,色譜純,美國 Fisher公司;IMP、GMP標準品,美國Sigma公司,IMP和GMP水合物的純度均為99%,其中,IMP水分含量26%,GMP水分含量21%;四丁基磷酸銨,色譜純,美國Sigma公司;磷酸二氫鉀,分析純,天津市廣成化學(xué)試劑有限公司.
e2695型高效液相色譜儀(配有可變波長紫外檢測器和示差檢測器,Empower色譜工作站),美國Waters公司;XS105DU型分析天平,德國梅特勒·托利多公司;Symmetry shiled RP18型分離柱,4.6 mm×150 mm,5 μm,美國 Waters公司.
洗脫液:0.02 mol/L磷酸二氫鉀(0.02%四丁基磷酸銨)的超純水溶液∶乙腈=97∶3(v/v);反相色譜柱(Symmetry shiled RP18,4.6 × 150 mm,5 μm);檢測波長254 nm;流速0.8 mL/min;進樣量5 μL.
分別稱取IMP、GMP標準品0.040 24,0.030 81 g,置于50 mL容量瓶中,用超純水超聲溶解并定容至刻度,搖勻,冷藏于保鮮柜,作為標準儲備液,該儲備液每毫升相當(dāng)于IMP干基589.64 μg,GMP干基481.92 μg,進樣前用 0.45 μm 微孔濾膜過濾.
稱取雞精樣品0.2 g左右(準確至0.000 1 g),用超純水超聲溶解并定容至25 mL,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜過濾后待測.
在50~480 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),HPLC的響應(yīng)峰面積與GMP的標準品濃度呈線性關(guān)系:y=12 180x-78 215(式中x為響應(yīng)峰面積,y為GMP的標準品濃度),相關(guān)系數(shù)R=0.999 9;在60~600 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),HPLC的響應(yīng)峰面積與IMP的標準品濃度呈線性關(guān)系:y=9 305.7x-85 880(式中x為響應(yīng)峰面積,y為IMP的標準品濃度),相關(guān)系數(shù)R=1.000 0.實驗建立的GMP與IMP的標準曲線圖如圖1和圖2;GMP與IMP的HPLC色譜圖如圖3和圖4.
圖1 GMP標準曲線Fig.1 GMP standard curve
圖2 IMP標準曲線Fig.2 IMP standard curve
圖3 GMP不同濃度標準品色譜圖Fig.3 GMP chromatogram of different concentrations standard samples
圖4 IMP不同濃度標準品色譜圖Fig.4 IMP chromatogram of different concentrations standard samples
參閱目前國內(nèi)外報道的呈味核苷酸二鈉高效液相色譜分離條件[4-9],先后采用了不同流動相對其分離效果進行了優(yōu)化選擇,結(jié)果如表1.
由表1可知,用普通的磷酸鹽緩沖液和碳十八色譜柱很難將二者完全分離,如圖5.而當(dāng)選擇辛烷磺酸鈉為離子對試劑時,樣品無保留,選擇四丁基磷酸銨效果較好.另外,流動相中乙腈的含量對分離效果影響較明顯,通過反復(fù)對比實驗論證,流動相中添加0.02%的四丁基磷酸銨,3%的乙腈分離效果最好,樣品分離效果的色譜圖如圖6.
表1 不同流動相組分對IMP和GMP分離效果的比較Tab.1 Effects of mobile phase composition on IMP and GMP separation effect comparison
優(yōu)化后的呈味核苷酸二鈉色譜分離條件可獲得分離度較好的譜圖,但由于流速過低,樣品保留時間不穩(wěn)定.通過更換色譜柱,采用System RP18反相柱,柱溫提高到40℃,流速提高到0.8 mL/min,獲得了定性重復(fù)性與定量重復(fù)性的相對標準偏差(RSD)<2%的樣品IMP和GMP的分離色譜圖,獲得了滿意結(jié)果.
圖5 流動相添加磷酸二氫鉀時IMP和GMP產(chǎn)品的色譜圖Fig.5 Production chromatogram of IMP and GMP(mobile phase containing potassium dihydrogen phosphate)
圖6 流動相添加磷酸二氫鉀和四丁基磷酸銨時色譜圖Fig.6 Production chromatogram of IMP and GMP(mobile phase containing potassium dihydrogen phosphate and tetrabutylammonium phosphate monobasic)
通過實驗分析,獲得了雞精樣品中呈味核苷酸二鈉的含量即:IMP質(zhì)量含量為0.54%,GMP質(zhì)量含量為0.60%,兩次測定結(jié)果的精密度 GMP為0.73%,IMP為1.17%,保留時間相對標準偏差RSD為0.036%和0.047%.譜圖如圖7.
圖7 優(yōu)化后的IMP和GMP含量色譜圖Fig.7 Chromatogram of IMP and GMP concentration in chicken extract under optimal condition
本文以四丁基磷酸銨和磷酸二氫鉀配以一定比例的乙腈為流動相,采用高耐水系Waters RP 18色譜柱,獲得了定性定量重復(fù)性均較優(yōu)的IMP和GMP分離方法,測得雞精樣品中呈味核苷酸二鈉的總質(zhì)量含量為1.14%,其中 IMP質(zhì)量含量為0.54%,GMP質(zhì)量含量為0.60%;測定結(jié)果的精密度GMP為0.73%,IMP為1.17%,檢測結(jié)果滿意.使用該方法測定IMP和GMP的HPLC色譜圖中,2種物質(zhì)的出峰時間均小于8 min,分離度較高,測定結(jié)果快速、簡單、準確可靠.本檢測方法的建立可為香精及其他食品添加劑中IMP和GMP的定性定量分析提供可靠的數(shù)據(jù)支持,同時可用于香精新配方中IMP和GMP的含量測定.
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(責(zé)任編輯:葉紅波)
Quantitative Determination of Disodium 5'-Inosinate and Disodium 5'-Guanylate in Chicken Extract by HPLC
XIANG Li-xin, YANG Dao-xing, WEI Yan-mei, YAN Bing-xia
(Jining Nature Foods Co.Ltd.,Jining 272075,China)
A high performance liquid chromatography method was established for quantitative determination of disodium 5'-inosinate and disodium 5'-guanylate(IMP and GMP).Using tetrabutylammonium phosphate monobasic and potassim dihydrogen phosphate mixed with a certain proportion of acetonitrile as the mobile phase,the standard samples were analyzed on Waters RP 18 column under the optimal conditions.The qualitative and quantitative reproducibility of RSD were below 2%.On the IMP standard curve,the linear range was 60 ~ 600 μg/mL,the correlation coefficient R being 1.000.On the GMP standard curve,the linear range was 50 ~480 μg/mL,the correlation coefficient R being 0.999 9.The method was used to determine IMP and GMP content in a certain brand of chicken extract,which was 0.54%and 0.60%,respectively,the precision being 0.73%for GMP,1.17%for IMP.
high performance liquid chromatography;disodium 5'-inosinate and diosidm 5'-guanylate;qualitative and quantitative reproducibility;RSD;chicken extract
TS264.2
A
1671-1513(2011)06-0032-03
2011-06-22
相麗新,女,碩士,主要從事食品及添加劑中安全指標的檢測方面的工作.