乳飲料中煙酸和煙酰胺的液相色譜檢測方法

王春天，戴洋洋，閆磊，張延超，馬文紅，鄭維君

（天津市乳品食品監(jiān)測中心，天津 300381）

乳飲料中煙酸和煙酰胺的液相色譜檢測方法

王春天，戴洋洋，閆磊，張延超，馬文紅，鄭維君

（天津市乳品食品監(jiān)測中心，天津 300381）

建立一種測定乳飲料中煙酸和煙酰胺含量的高效液相色譜法。樣品經(jīng)乙晴萃取后進(jìn)樣，采用C18100 mm×2.1 mm色譜柱分離，流動相為甲醇、異丙醇、庚烷磺酸鈉。紫外檢測；A-R261 nm，RSD為0.56%～0.82%（n=5），標(biāo)準(zhǔn)曲線r=0.9998，平均回收率分別為98.2%，煙酸最低檢出限為6.25 μg/100 g，煙酰胺最低檢出限為12.5 μg/100 g。

超高壓液相色譜（UPLC）；煙酸；煙酰胺；乳飲料

煙酸又名尼古丁酸，俗名VB5，化學(xué)名為吡啶-3-甲酸。分子式C6H5NO2，分子量123.11，為白色針狀結(jié)晶或粉末、熔點(diǎn)236℃～237℃,比重1.473。易溶于水、能溶于乙醇、氯仿和堿溶液，無臭、略帶酸味。在空氣中穩(wěn)定，毒性微。

煙酰胺俗名VB3，又名尼克酰胺，化學(xué)名為3-吡啶甲酰胺，分子式C6H6N2O，分子量122.13，為白色針狀結(jié)晶或粉末，熔點(diǎn)129℃～131℃，比重1.400。易溶于水、能溶于乙醇和甘油。無臭、略帶苦味，微毒。

有專家把煙酸看作是具有生物活性的吡啶-3-羧酸及其衍生物的總稱，煙酰胺是它在動物體內(nèi)的作用存在形式，煙酸的活性結(jié)構(gòu)簡單，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不易被酸、堿、熱所破壞。預(yù)混料中的煙酸在5、25、35℃溫度下存儲24個月，保有率99%。因而被認(rèn)為是最穩(wěn)定的維生素[1]。

早在1926年I.Golddberger等發(fā)現(xiàn)VB5中含有預(yù)防和治療糙皮病的因子，1937年C.A.Elvehijiem等分離出煙酸，不久又在肝臟中獲得了煙酰胺。由于它們的生理作用相仿，故一起被命名為抗糙皮病維生素。煙酸和煙酰胺是B族維生素物質(zhì)，主要存在于腎、肝、肌肉、乳汁、蛋黃、花生和水果中。

我國現(xiàn)有乳制品中煙酸、煙酰胺的檢測方法只有針對于乳粉的相關(guān)檢測，而對于乳飲料的適用性較差，本方法的研究目的是為了建立一種適用于乳飲料中煙酸、煙酰胺的檢測方法，進(jìn)一步完善了國家標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于乳制品中煙酸、煙酰胺的檢測方法[2]。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

1.1.1 試劑

甲醇、異丙醇、庚烷磺酸鈉、乙腈、煙酸和煙酰胺（標(biāo)準(zhǔn)品，不少于99%），其余試劑為分析純，水為去離子水。

1.1.2 測試樣品

乳飲料。

1.2 儀器和設(shè)備

超高壓液相色譜WATERS UPLC（帶紫外檢測器）；分析天平（0.0001 g）；濾膜（有機(jī)相，0.22 μm）。

1.3 方法提要及原理

樣品經(jīng)乙腈+去離子水萃取后，過濾出去蛋白質(zhì)和脂肪后，離心，經(jīng)超高壓液相色譜儀測定，保留時間定性，峰面積定量。

1.4 測定步驟

1.4.1 提取

精確稱取樣品15.000 g放入100 mL容量瓶中。準(zhǔn)確加入乙腈+去離子水（比例為30+70）定容到100 mL，劇烈振蕩2 min后，靜置30 min，取上清液于高速離心機(jī)中離心，取濾液適量用0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾，濾液備用待測。

1.4.2 測定

分別取5 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品待測液注入高壓液相色譜儀進(jìn)行分析，得到組分的色譜峰。以保留時間定性，用組分的色譜峰峰面積定量。

1.4.2.1 儀器條件

色譜柱：C18柱，1.7 μm，2.1 mm×100 mm（或相當(dāng)型號色譜柱）；

流動相：甲醇70mL，異丙醇20mL，庚烷磺酸鈉1g,用910 mL水溶解并混勻后，用高氯酸調(diào)pH至2.1±0.1，經(jīng) 0.22 μm 膜過濾[3]。

流速：0.4 mL/min；

紫外檢測器波長：261 nm；

進(jìn)樣量：5 μL。

1.4.2.2 空白試驗(yàn)

除不加試樣外，采用完全相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。

1.5 結(jié)果計算

試樣中煙酸煙酰胺含量以X表示，單位為（μg/100 g）按式（1）計算。

式中：S為試樣中煙酸煙酰胺的峰面積；S0為標(biāo)準(zhǔn)溶液中煙酸煙酰胺的峰面積；C0為標(biāo)準(zhǔn)溶液中煙酸煙酰胺的濃度，（μg/mL）；V 為樣液最終定容體積，（mL）；m 為稱樣量，（g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

煙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積響應(yīng)值，見表1。

表1 煙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積Table 1 Nicotinic acid concentration and peak area of standard solution

圖1 煙酸在不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液與峰面積的線性關(guān)系Fig.1 Nicotinic acid standard solution of different concentration and the linear relationship between peak area

煙酸在0～5 μg/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9999，回歸方程為y=47943x-475.68。

表2 煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積Table 2 Nicotinamide concentration and peak area of standard solution

圖2 煙酰胺在不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液與峰面積的線性關(guān)系Fig.2 Nicotinamide standard solution of different concentration and the linear relationship between peak area

煙酰胺在0～5 μg/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9994回歸方程為y=52614x+1932.6。

2.2 準(zhǔn)確度和精密度

2.2.1 準(zhǔn)確度

通過對乳飲料中樣品在不同濃度水平上（0.3、5.00、10.0、30.0 mg/kg）加標(biāo)，回收率最低為 91.98%，最高為108.4%。說明本方法測定乳制品中煙酸煙酰胺是具有較好準(zhǔn)確度的，結(jié)果見表3。

表3 本方法測定加標(biāo)樣品的回收率Table 3 Determination of sample this method the recovery rate

煙酸回收率最低為91.98%，最高為102.0%，平均為97.18%。煙酰胺最低為93.21%，最高為108.4%，平均為97.32%。說明本方法測定乳制品中煙酸、煙酰胺具有較高的準(zhǔn)確度。

2.2.2 精密度

經(jīng)過對陽性樣品的18次平行測定得到數(shù)據(jù)的統(tǒng)計計算，陽性樣品（煙酸煙酰胺）結(jié)果的變異系數(shù)分別為1.9%、2.9%，證明方法精密度良好，達(dá)到測試要求水平。

乳飲料煙酸陽性樣品結(jié)果的變異系數(shù)為2.9，煙酰胺陽性樣品結(jié)果的變異系數(shù)為3.3，證明方法精密度良好，達(dá)到檢測要求，結(jié)果見表4。

表4 本方法測定的陽性樣品18次平行試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The determination of positive sample 18times in parallel experimentsμg/100g

2.2.3 檢出限

經(jīng)測定煙酸方法檢出限6.25 μg/100 g，煙酰胺的方法檢出限 12.5 μg/100 g。

表5 煙酸的檢出限Table 5 The detection limit of nicotinic acid

煙酸煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)品譜圖，分離效果非常好，結(jié)果見圖3。

表6 煙酰胺的檢出限Table 6 The detection limit of nicotinamide

圖3 煙酸煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品譜圖Fig.3 Nicotinic acid and nicotinamide standard spectrum

乳飲料中煙酰胺的譜圖，分離效果好，而且目標(biāo)峰附近沒有雜峰，峰型也很好，見圖4。

圖4 乳飲料中煙酰胺的譜圖Fig.4 Nicotinamide spectrum of dairy products

乳飲料中煙酸的譜圖，分離效果好，而且目標(biāo)峰附近沒有雜峰，峰型也很好，見圖5。

圖5 乳飲料中煙酸的譜圖Fig.5 Nicotinic acid spectrum of dairy products

樣品中煙酸煙酰胺加標(biāo)譜圖，峰型很好，沒有肩峰和拖尾現(xiàn)象，說明加標(biāo)效果好，見圖6。

3 結(jié)論

通過對多個批次不同品牌不同類型乳飲料的測定，測得其精密度與準(zhǔn)確度均能達(dá)到要求，本方法對大多數(shù)乳飲料的煙酸、煙酰胺的測定均適用。

圖6 樣品中煙酸煙酰胺加標(biāo)譜圖Fig.6 Standard spectra of dairy products

[1]羅澆燕,周洪偉,林玉娜.快速測定食品中煙酰胺、維生素B1、B6含量[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005(6)

[2]GBT 5009.197-2003保健食品中鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、煙酰胺和咖啡因的測定

[3]GB 5413.15-2010嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定

Dairy Products Nicotinic Acid and Nicotinamide Liquid Chromatography Detection Methods

WANG Chun-tian,DAI Yang-yang,YAN Lei,ZHANG Yan-chao,MA Wen-hong,ZHENG Wei-jun
（Dairy Food Monitoring Center，Tianjin 300381，China）

To establish a milk drink determination of nicotinic acid and nicotinamide by HPLC method.The sample was extracted with acetonitrile,C18100 mm×2.1 mm column with mobile phase of methanol,isopropanol,heptane sulfonate.UV detection;A-R261 nm,RSD is 0.56%-0.82%（n＝5）,the correlation coefficients were more than 0.9998,the recoveries were 98.2%.The detection limit of nicotinic acid was 6.25μg/100 g,the detection limit of Nicotinamide was 12.5μg/100 g.

high pressure liquid chromatography（Waters UPLC）;nicotinic acid;nicotinamide;milk drink

王春天（1975—），男（漢），助理工程師，?？?，研究方向：乳制品和食品中營養(yǎng)成分，加工添加成分及農(nóng)獸藥殘留的檢測。

2010-09-01