大孔吸附樹脂對類胡蘿卜素的靜態(tài)吸附研究

劉卉琳，劉紹，2，蘭時樂，謝達(dá)平，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

大孔吸附樹脂對類胡蘿卜素的靜態(tài)吸附研究

劉卉琳1，劉紹1，2，蘭時樂3，謝達(dá)平3，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

為尋找大孔吸附樹脂對粘性紅圓酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳純化條件，比較了6種大孔吸附樹脂對類胡蘿卜素的靜態(tài)吸附能力，并對所選擇樹脂的吸附最佳條件和解吸條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，DS-401型大孔吸附樹脂具有最佳的吸附和洗脫參數(shù)，其最佳工藝為在pH為6.0、溫度為25℃、時間為1 h的條件下吸附率最大，可達(dá)80.58%，此時選用100%石油醚做解吸劑，于30℃解吸1 h，解吸率最大，可達(dá)95.32%。

類胡蘿卜素；大孔吸附樹脂；吸附；解吸

隨著類胡蘿卜素在人們生活、醫(yī)療、保健上的作用日益受到關(guān)注，隨著天然類胡蘿卜素用量的不斷增加，開發(fā)利用天然類胡蘿卜素資源已是大勢所趨。

本文在前期類胡蘿卜素的微生物合成研究基礎(chǔ)上，研究了大孔吸附樹脂對粘性紅圓酵母發(fā)酵生產(chǎn)的類胡蘿卜素的吸附解吸特性，以篩選出適合純化類胡蘿卜素的大孔吸附樹脂，為類胡蘿卜素分離純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：粘性紅圓酵母（Rhodotorula mucilaginosa）b－5（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技學(xué)院微生物實驗室保藏）。斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，pH6.0。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：3.2%葡萄糖，1.8%NH4NO3，0.2%酵母膏，0.03%MgSO4·7H2O，0.1%KH2PO4。β-胡蘿卜素對照品：購自天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器藥品有限公司；大孔吸附樹脂：AB－8和X－5購于南開大學(xué)化工廠；D－101和DS－401：購于天津市海光化工有限公司；HP20：購于日本三菱化工；HPD400：購于滄州寶恩化工有限公司。恒溫?fù)u床（SYC－L）：上海聯(lián)歡生物工程設(shè)備有限公司；可見分光光度計（VIS－723N）：北京瑞利分析儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH－4）：上海浦東物理光學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取一定量的β-胡蘿卜素對照品，用少量三氯甲烷溶解后，再用石油醚定容，配制成質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL的溶液。精密吸取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于7只10 mL 容量瓶中，加入石油醚定容，搖勻，于450 nm處測定其吸光度。以溶液質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.2875x+0.0039，R2=0.9993。

1.2.2 類胡蘿卜素的微生物發(fā)酵

挑取活化好的粘性紅圓酵母菌株，接種于種子培養(yǎng)基上（裝液量為30 mL/250 mL三角瓶），28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，以此作為種子液。吸取種子液2.5mL接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量為50mL/250 mL三角瓶），28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，即得含類胡蘿卜素的發(fā)酵液。

1.2.3 類胡蘿卜素的提取

取發(fā)酵液10 mL于3500 r/min下離心15 min，沉淀即為濕菌體，在其中直接加入10 mL 3 mol/L鹽酸，于28℃下振蕩浸泡1 h，然后置入沸水浴中保持4 min，再迅速冷卻，于3500 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀以蒸餾水洗滌3次后加入10 mL丙酮，28℃下振蕩浸泡2 h，然后3500 r/min離心15 min。上清液即為類胡蘿卜素的提取液[3]。

1.2.4 樹脂的預(yù)處理

各種大孔吸附樹脂以95%的乙醇溶液浸泡24 h后，用蒸餾水洗至中性，于2%HCl溶液中浸泡12 h，然后用蒸餾水洗至中性，再以2%NaOH溶液浸泡12 h，最后用蒸餾水洗至中性，濕法保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 靜態(tài)吸附試驗

1.2.5.1 大孔吸附樹脂的選擇

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好并用濾紙充分吸干水分的AB-8，X-5，D-101，DS-401，HP20和HPD400樹脂各1.0 g于棕色具塞瓶中，每瓶中精密量取10 mL色素提取液，吸附30 min，用723型可見分光光度計于450 nm處測定吸附前和吸附后的吸光度，計算各樹脂對類胡蘿卜素的吸附率。吸附率/%=（吸附前吸光度×吸附液體積－吸附后吸光度×吸附液體積）/（吸附前吸光度×吸附液體積）。

1.2.5.2 樹脂的靜態(tài)動力吸附試驗

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好并用濾紙充分吸干水分的X-5和DS-401樹脂1.0 g，分別置于棕色具塞瓶中，每瓶中精密量取10 mL色素提取液，置于20℃的恒溫水浴搖床上，每隔15 min取樣于450 nm處測定吸光度，吸附2 h，計算樹脂的吸附率，并繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

1.2.5.3 pH的選擇

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好并以濾紙充分吸干水分的6份DS-401樹脂各1.0 g于棕色具塞瓶中，每瓶中精密量取10 mL色素提取液，分別調(diào)節(jié)pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，置于20℃的恒溫水浴搖床上，吸附1 h后，于450 nm處測定吸光度，計算不同pH下DS-401樹脂對類胡蘿卜色素的吸附率。

1.2.5.4 溫度的選擇

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好并以濾紙充分吸干水分的6份DS-401樹脂各1.0 g于棕色具塞瓶中，每瓶中精密量取10 mL色素提取液，調(diào)pH為6.0，分別將具塞瓶置于10、15、20、25、30、35 ℃的恒溫水浴搖床上，吸附1 h后，于450 nm處測定吸光度，計算不同溫度下DS-401樹脂對類胡蘿卜色素的吸附率，并比較其大小。

1.2.6 靜態(tài)解吸試驗

1.2.6.1 洗脫液的選擇[4]

取1.0 g吸附好類胡蘿卜素的DS-401樹脂6份，分別加入石油醚、乙醚、丙酮、己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃洗脫劑各10 mL，室溫下解吸1 h后，取上清液，于450 nm處測定吸光度，根據(jù)樹脂的吸附量計算解吸率[5]。

式中：Q為吸附量，（mg/g）；D為解吸率，%；C0起始濃度，（mg/mL）；C1為吸附后剩余液濃度，（mg/mL）；V為溶液體積，mL；W為干樹脂重量，g；C2為解吸液濃度，（mg/mL）；V2為解吸液體積，mL。

1.2.6.2 洗脫液比例的選擇

取1.0 g吸附好類胡蘿卜素的DS-401樹脂6份，按照不同比例（見表1）分別加入石油醚和乙醚共10 mL，室溫下解吸1 h后，取上清液，于450 nm處測定吸光度，根據(jù)樹脂的吸附量計算解吸率。

表 1 石油醚與乙醚不同含量Table 1 The content of the petroleum ether and aether

1.2.6.3 洗脫溫度和時間的選擇

取1.0 g吸附好類胡蘿卜素的DS-401樹脂5份，加入石油醚10 mL，分別放于10、15、20、25、30 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)，每隔15 min取上清液，于450 nm處測定吸光度，解吸2 h后，根據(jù)樹脂的吸附量計算解吸率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樹脂吸附率比較結(jié)果

6種大孔吸附樹脂對類胡蘿卜素的吸附情況如圖1所示。

由圖1可知，X-5和DS-401樹脂對類胡蘿卜素的吸附率較高，可通過對其靜態(tài)吸附動力學(xué)的研究，進(jìn)一步篩選最佳樹脂。

2.2 樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線，見圖2。

由圖2可以看出，2種吸附樹脂在吸附60 min時，樹脂的吸附率達(dá)到最大，隨著時間繼續(xù)延長，吸附率不但沒有增大，反而減少，這可能是由于類胡蘿卜素與空氣接觸被氧化的結(jié)果。因此，采用1 h作為吸附時間。在1 h內(nèi)DS-401樹脂的吸附率始終高于X-5，最終確定選用DS-401樹脂進(jìn)行靜態(tài)的吸附和解吸試驗。

2.3 pH對吸附率的影響

DS-401樹脂對不同pH的樣品溶液中類胡蘿卜素的吸附情況，見圖3。

由圖3可知，當(dāng)pH為1.0至6.0時，樹脂的吸附率呈逐漸升高趨勢，且當(dāng)pH為6.0時，樹脂的吸附率最大，此后，隨著pH的增加，吸附率降低。這可能是由于該類胡蘿卜素內(nèi)含有一定量的羧基（-COOH），呈現(xiàn)一定的酸性，因此在微酸性條件下易被樹脂吸附。這與報道中紅酵母紅素（圖4）的結(jié)構(gòu)式相符[6-7]。

2.4 不同溫度對吸附率的影響

在不同吸附溫度下，DS-401樹脂對pH為6.0的類胡蘿卜素溶液的吸附情況，見圖5。

由圖5可知，當(dāng)溫度從10℃上升至35℃，樹脂的吸附率呈現(xiàn)先逐漸升高后降低的趨勢，當(dāng)溫度為25℃時，樹脂的吸附率最大，可達(dá)80.58%。由于類胡蘿卜素的熱穩(wěn)定性不高，所以選擇的吸附溫度不宜過高，而溫度過低，由于吸附反應(yīng)速度太慢，往往在短時間內(nèi)達(dá)不到平衡。因此，最佳吸附溫度確定為25℃。

2.5 不同洗脫液的解吸率比較結(jié)果

不同洗脫液的解吸率比較結(jié)果，見圖6。

從圖6可以看出，選用了6種不同的洗脫液對吸附好的DS-401樹脂進(jìn)行洗脫，石油醚和乙醚的洗脫效果較其他洗脫液的效果好。因此，選用石油醚和乙醚進(jìn)行洗脫實驗。

2.6 不同石油醚與乙醚的配比對解吸率的影響

2種不同洗脫液對解吸效果的影響，見圖7。

由圖7可以看出，隨著乙醚的用量逐漸減少，石油醚的用量逐漸增多，解吸效果呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，說明2種洗脫液分別解吸的效果優(yōu)于混合的效果，而100%石油醚的效果最好。因此，選用石油醚作為洗脫液。

2.7 不同溫度和時間對解吸率的影響

不同溫度和時間對解吸率的影響，見圖8。

由圖8可以看出，隨著溫度的升高，類胡蘿卜素在樹脂上的吸附能力降低，解吸率逐漸增加；在溫度為10、15、20、25 ℃時，隨著時間的增加，解吸率呈增加趨勢，在解吸1 h后解吸率增加趨勢減緩；在溫度為30℃時，開始時隨著時間的增加，解吸率呈增加趨勢，直至解吸1 h時解吸率達(dá)最大值95.32%，隨后隨著時間繼續(xù)增加，解吸率降低后趨于穩(wěn)定，說明該情況下解吸效果并不是時間越長越好。可見，本實驗條件下，于30℃解吸1 h對類胡蘿卜素的解吸效果最佳。

3 結(jié)論

靜態(tài)吸附試驗表明DS-401型大孔吸附樹脂是吸附粘性紅圓酵母產(chǎn)生的類胡蘿卜素效果較好的樹脂。進(jìn)一步的靜態(tài)吸附和解吸試驗表明發(fā)酵提取液在溫度為25℃，pH為6.0，吸附1 h的條件下吸附率最大可達(dá)到80.58%。選用100%石油醚做洗脫劑，于30℃解吸1 h，解吸率最大，可達(dá)95.32%。大孔吸附樹脂價格低廉，可反復(fù)使用，現(xiàn)已廣泛用于天然植物中的活性成分，但對微生物產(chǎn)生的類胡蘿卜素的純化鮮見報道，研究具有相當(dāng)?shù)膶嵱脙r值和指導(dǎo)意義。

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Study on the Static Adsorption for Purification of Carotenoid by Macroporous Resin

LIU Hui－lin1，LIU Shao1，2，LAN Shi－le3，XIE Da－ping3，*

（1.College of Bio－Safety Science＆ Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2.College of Food Science＆ Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；3.College of Bio－Science ＆ Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，410128，Hunan，China）

An optimal macroporous adsorption resin was chosen to purify the carotenoid produced by Rhodotorula mucilaginosa.And its conditions of static adsorption and desorption were studied in this paper.The result show that DS－401 resin was of excellent adsorption and desorption performance to carotenoid.The optimal adsorption condition was pH6.0，25 ℃ ，1 h，adsorption rate was up to 80.58% .The optimal desorption condition was 30℃，1 h while 100%petroleum ether was taken as the optimal eluent，the desorption rate was up to 95.32%.

carotenoid；macroporous adsorption resin；adsorption；desorption

*通信作者：謝達(dá)平（1945—），男，博士生導(dǎo)師，主要從事酶學(xué)理論與應(yīng)用研究。中提取受制于季節(jié)，同時要求有比較高的下游處理技術(shù)，并且產(chǎn)量相對比較低，成本相當(dāng)高。近年來，人們對微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素進(jìn)行了大量的研究。截止目前人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生類胡蘿卜素的微生物有真菌、細(xì)菌和藻類等。這些微生物中，紅酵母因其營養(yǎng)要求簡單，成本低，發(fā)酵周期短，含有豐富的蛋白質(zhì)，菌體可綜合利用[2]，因此具有較大的應(yīng)用價值和發(fā)展前景。

眾所周知，類胡蘿卜素在淬滅自由基、增強人體免疫力、促進(jìn)細(xì)胞縫間聯(lián)接交流和減少慢性疾病等保護(hù)人類健康方面起著相當(dāng)重要的作用。

一般來說，類胡蘿卜素主要通過化學(xué)合成法，植物提取法和微生物發(fā)酵法得到[1]。其中化學(xué)合成法副產(chǎn)物多，選擇性差，操作條件需高溫高壓，成本也高。從植物

劉卉琳（1983—），女（侗），在讀博士，研究方向：微生物工程與制劑方面。

2011-03-07