廣豆根不同溶劑提取物清除自由基活性研究

王凱，張業(yè)，義祥輝，劉賢賢,*，潘英明，黃麗娟，譚丁弦

（1.桂林師范高等?？茖W(xué)校化學(xué)與工程技術(shù)系，廣西 桂林 541001；2.廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 桂林 541004）

廣豆根不同溶劑提取物清除自由基活性研究

王凱1，張業(yè)1，義祥輝1，劉賢賢1,*，潘英明2，黃麗娟1，譚丁弦1

（1.桂林師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與工程技術(shù)系，廣西 桂林 541001；2.廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 桂林 541004）

對(duì)廣豆根水提取物（WE）、乙醇提取物（EE）、乙酸乙酯提取物（EAE）和丙酮提取物（AE），各提取物的總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，并研究了其DPPH自由基、ABTS自由基清除活性。結(jié)果表明，4種提取物總黃酮含量分別為49.81μg/mg（EE）、27.98μg/mg（WE）、67.7μg/mg（AE）、106.36μg/mg（EAE）。且各提取物均具有較強(qiáng)的自由基清除活性，其活性順序?yàn)镋E>EAE>AE>WE。除EE之外，WE、EAE與AE中總黃酮含量與其自由基清除活性成分存在一定的相關(guān)性。

廣豆根；總黃酮含量；DPPH自由基；ABTS自由基

抗氧化劑是一種重要的食品添加劑，不但能用于阻止或延緩油脂的自動(dòng)氧化，防止食品在貯藏過(guò)程中因氧化而褐變、褪色、使?fàn)I養(yǎng)損壞，同時(shí)還可以作為一類重要的生物活性物質(zhì)，清除人體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，具有延緩機(jī)體衰老的功效，從而成為新世紀(jì)以來(lái)研究的熱點(diǎn)[1]。但研究表明，一些人工合成食品抗氧化劑如BHT和BHA具有一定的毒副作用，因此人們把抗氧化劑研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了天然、低毒、高效的天然抗氧化劑[2-3]。而部分植物中所含有的活性成分具有羥基取代的高反應(yīng)性和強(qiáng)的吞噬自由基能力，故其抗氧化性能非常卓越，從而被作為天然自由基清除劑的重要來(lái)源。

廣豆根為豆科物柔枝槐（Sophora subprostrata Chun et T.Chen）的根，藥用于治療咽喉牙齦腫痛、肺熱咳嗽煩渴、黃疸、熱結(jié)便秘[4]，但其自由基清除活性國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。為挖掘廣豆根的潛在藥用價(jià)值，對(duì)廣豆根4種不同溶劑提取物總黃酮含量及其自由基清除活性進(jìn)行了研究，并探討了其總黃酮含量與自由基清除活性之間的關(guān)系，以期為廣豆根的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器設(shè)備

廣豆根購(gòu)于桂林國(guó)藥大藥房，45℃烘干，粉碎后保存?zhèn)溆?；二苯代苦味酰自由基（DPPH）、2，2’－連氮基－雙－（3－乙基苯并二氫噻唑啉－6－磺酸）二銨鹽（ABTS）：均購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；DJ-02靈巧型粉碎機(jī)：上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 廣豆根不同提取物的制備

將廣豆根藥材粗粉過(guò)篩（30目），隨后稱取藥粉5 g分別用水、丙酮、乙酸乙酯、乙醇4種不同極性溶劑（50 mL）在室溫下置于超聲波提取設(shè)備中提?。?0 min，功率90 W），重復(fù)3次，抽濾，合并濾液。合并液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到浸膏，計(jì)算產(chǎn)率，置冰箱備用。各提取物的產(chǎn)率分別為12.9%（EE）、11.7%（WE）、6.0%（AE）、4.0%（EAE）。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[5]法，將提取液（1 mL，0.1 mg/mL）溶解于5 mL蒸餾水，加入NaNO2水溶液（0.3 mL，5%）混合均勻后靜置5 min，隨后加入AlCl3（0.6 mL，10%），再靜置5 min，最后加入NaOH水溶液（2 mL，1 mol/L），在510 nm之下測(cè)定吸光度。并以兒茶素為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，總黃酮含量以μg/mg表示。

1.2.3 DPPH自由基清除法

參照文獻(xiàn)[5]法，分別移取上述不同濃度的廣豆根樣品溶液與DPPH溶液按一定比例混合均勻，在37℃水浴恒溫30 min，隨后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（Atest），并測(cè)定不加任何提取液的DPPH溶液的吸光度（Acontrol）。通過(guò)下面公式計(jì)算自由基清除率SC%：SC%=[（Acontrol-Atest）/Acontrol]×100%。并繪制廣豆根各提取液濃度-SC%曲線。再通過(guò)線性擬合方程求樣品對(duì)DPPH自由基清除的半抑制濃度值（IC50）。

1.2.4 ABTS自由基清除法

參照文獻(xiàn)[5]法，首先用pH為7.4磷酸緩沖溶液配制ABTS標(biāo)準(zhǔn)液（50 mL，2 mmol/L），將此溶液與K2S2O8水溶液（200 mL，70 mmol/L）充分混合后再暗處放置15 h～16 h（過(guò)夜）。隨后用蒸餾水調(diào)節(jié)ABTS·+溶液在734 nm的吸光度為0.700±0.030。移取不同濃度的樣品溶液與ABTS·+溶液按照一定比例室溫下混合，避光靜置3 min后734 nm下測(cè)定其吸光度（Atest），并測(cè)定不加任何提取液的ABTS溶液的吸光度（Acontrol）。通過(guò)下列公式計(jì)算自由基清除率SC%：自由基清除率SC=[（Acontrol-Atest）/Acontrol]×100%。隨后繪制廣豆根提取液濃度-SC%曲線，再通過(guò)線性擬合方程求樣品對(duì)ABTS自由基清除的半抑制濃度值（IC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 各提取物總黃酮含量

黃酮類物質(zhì)是許多天然植物提取物的自由基清除劑活性成分，具有抗癌、護(hù)肝、抗炎、抗過(guò)敏、抑菌、抗病毒等作用。本文采用兒茶素當(dāng)量來(lái)表示各提取物中總黃酮含量。兒茶素總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

其線性回歸方程為：

由此可求出廣豆根各產(chǎn)物的總黃酮，表示為μg兒茶酚/mg干固體。各提取物總黃酮含量見(jiàn)表1。

表 1 各提取物總黃酮含量與自由基清除活性關(guān)系Table 1 Relationship between total flavonoid and free radical scavenging activity of extracts

其大小分別為49.81、27.98、67.7、106.36μg/mg，含量大小順序關(guān)系為WE>EE>EAE>AE。

2.2 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基在有機(jī)醇溶劑中是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，DPPH含有一個(gè)單電子，在517 nm附近有強(qiáng)吸收（呈深紫色），當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，單電子被配對(duì)，紫外吸收減弱或消失。因此通過(guò)測(cè)定紫外吸收減弱的程度，可評(píng)價(jià)該自由基清除劑的活性。由于DPPH自由基對(duì)受試物活性成分靈敏度較高，而且操作簡(jiǎn)單易行，這種方法得到了廣泛的應(yīng)用。通常用清除率表示清除能力。清除率越大，表明該物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力越強(qiáng)。廣豆根各提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用見(jiàn)圖2。

由圖2表明，廣豆根的不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基均具有良好的清除能力，且清除率均隨質(zhì)量濃度增加而增大，說(shuō)明不同廣豆根提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力與其濃度都存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。而不同的提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力有一定的差異，相同濃度時(shí)，清除率從強(qiáng)到弱的順序?yàn)镋E>EAE>AE>WE。當(dāng)提取物濃度為0.02 mg/mL時(shí)，4種提取物對(duì)DPPH自由基的清除率依次為89.83%、83.51%、81.39%、45.77%。

2.3 ABTS自由基清除活性

ABTS自由基清除法是根據(jù)ABTS與K2S2O8反應(yīng)而生成ABTS·+，然后通過(guò)測(cè)定自由基體系在加入自由基清除劑之后的吸光度變化而評(píng)價(jià)對(duì)自由基清除劑的清除活性。廣豆根各提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用見(jiàn)圖3?？芍?，通過(guò)對(duì)廣豆根提取物的ABTS自由基清除試驗(yàn)，得知廣豆根的不同溶劑提取物均對(duì)ABTS自由基都有良好的清除作用，清除率都隨質(zhì)量濃度增加而增加。但從總體上看不同溶劑的提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用不盡相同，從強(qiáng)到弱的順序與2.1中對(duì)DPPH自由基清除活性順序一致，為EE>EAE>AE>WE。當(dāng)提取液濃度為0.05 mg/mL時(shí)，各提取物對(duì)ABTS自由基的清楚率依次為90.17%、85.6%、77.61%、73.54%。

2.4 提取物自由基清除活性與其總黃酮含量關(guān)系

清除自由基一半濃度時(shí)所需自由基清除劑的濃度稱為自由基清除的半抑制濃度即IC50值（The inhibitory concentration at which free radicals were scavenged by 50%），通常被用來(lái)評(píng)價(jià)化合物對(duì)自由基的清除能力的大小。IC50值越低，說(shuō)明自由基清除劑對(duì)自由基的清除能力越強(qiáng)。廣豆根的不同溶劑提取溶液對(duì)DPPH與ABTS自由基的 IC50見(jiàn)表1?？芍?，從IC50值可以看出，除EE之外，WE、EAE與AE自由基清除活性隨總黃酮含量而遞增，由此可推測(cè)WE、EAE與AE自由基清除活性成分與其總黃酮含量存在一定的關(guān)系，而EE中黃酮與其自由基清除活性關(guān)系不大。

3 結(jié)論

廣豆根的不同溶劑提取物均具有較強(qiáng)的自由基清除能力。不同溶劑提取物的自由基清除活性強(qiáng)弱順序?yàn)椋篍E>EAE>AE>WE。即在相同質(zhì)量濃度下，EE的清除活性最強(qiáng)，EAE和EE次之，WE最弱。WE、EAE與AE抗氧化活性與其總黃酮含量存在一定的關(guān)系，而EE所含主要的抗氧化活性成分可能還有其他多酚類物質(zhì)?？傊?，廣豆根作為一種華南地區(qū)常見(jiàn)中藥，其提取物均不失為良好的天然無(wú)毒的綠色自由基清除劑，具有作為自由基清除劑開(kāi)發(fā)和利用的價(jià)值。如果將其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，從中篩選出具有自由基清除活性的單體化合物，這無(wú)疑將更具研究?jī)r(jià)值與開(kāi)發(fā)前景。

[1]Pan Y M,Zhu J C,Wang H S.et al.Antioxidant activity of ethanolic extract of Cortexfraxini and use in peanut oil[J].Food chemistry,2007,103(3):913-918

[2]熊皓平，楊偉麗，張友勝，等.天然植物抗氧化劑的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2001，13(5)：75-79

[3]潘英明，梁英，朱志仁，等.槐花米抗氧化成分的提取及其活性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2007，27(2)：41-44

[4]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：上冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986：1319

[5]Wang K,Pan Y M,Wang H S.et al.Antioxidant activities of Liquidambar formosana Hance leaf extracts[J].Medicinal chemistry research,2010,19:166-176

Study on Free Radical Scavenging Activity of Different Solvents Extracts from the Root of Sophora subprostrata Chun et T.Chen

WANG Kai1，ZHANG Ye1，YI Xiang－h(huán)ui1，LIU Xian－xian1，*，PAN Ying－ming2，HUANG Li－juan1，TAN Ding－xian1
（1.Department of Chemistry and Engineering Technology，Guilin Normal College，Guilin 541001，Guangxi，China；2.College of Chemistry ＆ Chemical Engineering，Guangxi Normal University，Guilin 541004，Guangxi，China）

The total avonoids content of water extract（WE），ethanol extract（EE），ethyl acetate extract（EAE）and acetone extract（AE）of the root of Sophora subprostrata Chun et T.Chen were measured as well as their DPPH free radical and ABTS free racdical scavenging activity were determined.The results indicated that the total avonoids conten of extracts were 49.81μg/mg（EE），27.98μg/mg（WE），67.7μg/mg（AE），106.36μg/mg（EAE）.And all extracts showed strong free radical scavenging activity with the orders were：EE＞EAE＞AE＞W(wǎng)E.There is a relationship between the radical scavenging activity and total avonoids content of all extracts except EE.

the root of Sophora subprostrata Chun et T.Chen；total avonoids content；DPPH free radical；ABTS radical

廣西青年基金（0832024）；廣西醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)人才小高地項(xiàng)目（0808）；廣西區(qū)教育廳科研項(xiàng)目（No.200911MS281、No.200911MS 282）

王凱（1984—），男（漢），碩士，研究方向：天然產(chǎn)物提取分離與活性篩選。

*通信作者

2011-03-14