肝纖維化形成過程中大鼠血清中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白－2的動(dòng)態(tài)變化

申鳳俊，趙彩霞， 唐 瑾 (山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院消化科，太原 030001;通訊作者，E-mail:919016603@qq.com)

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到終末期的必經(jīng)階段，正常時(shí)肝的纖維組織形成和降解保持平衡，如果形成增多而降解減少則可導(dǎo)致肝纖維化。許多細(xì)胞因子通過復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肝纖維化的形成中發(fā)揮著重要的作用［1］。胰島素樣生長結(jié)合蛋白－2(insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP-2)屬于胰島素樣生長因子家族，可通過胰島素樣生長因子(IGF)依賴性和非IGF依賴性作用發(fā)揮其生物學(xué)功能，與肝纖維化的形成發(fā)展關(guān)系密切［2］。本實(shí)驗(yàn)采用CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型作為研究對象，探討血清IGFBP-2在大鼠肝纖維化形成過程中的動(dòng)態(tài)變化，并進(jìn)一步明確血清IGFBP-2與肝纖維化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性Wistar大鼠，體重(200±20)g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室提供，四氯化碳(CCl4)購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。IGFBP-2酶聯(lián)免疫分析試劑盒產(chǎn)自上海西唐生物有限科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCl4肝纖維化大鼠模型制備及動(dòng)物分組

將36只大鼠隨機(jī)分為2組:正常對照組6只，模型組30只。除正常對照組外，給予大鼠40%CCl4皮下注射，每周2次，共計(jì)8周。首次皮下注射劑量為5 ml/kg，以后為2 ml/kg。每周稱重1次，根據(jù)體重調(diào)整CCl4用量。正常對照組給予相同劑量的油劑皮下注射，并于8周末將正常對照組大鼠6只全部處死，留取血及肝組織，同時(shí)測定下述各指標(biāo)。各組大鼠試驗(yàn)期間均予飲用水及普通飼料喂養(yǎng)。模型組在開始注射CCl4后的第2、4、6、8周末在同等條件下分別處死大鼠6只，留取血及肝組織標(biāo)本，同時(shí)測定下述各指標(biāo)。

1.2.2 常規(guī)病理檢查 肝組織用10%中性福爾馬林液固定，并進(jìn)行常規(guī)HE與Masson三色染色，光鏡下觀察肝組織標(biāo)本。應(yīng)用Leica Q500IW圖像分析系統(tǒng)(德國)對Masson三色染色的肝組織進(jìn)行圖像處理。在10×10倍光鏡下，攝取圖像，測定標(biāo)準(zhǔn)光欄中膠原(綠色)的面積，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)視野以匯管區(qū)為中心，計(jì)算膠原的面積比(面積比=膠原面積/視野中肝臟面積×100%)。

1.2.3 血清肝功測定 ALT水平應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測定，由專人操作。

1.2.4 門靜脈壓力測定 山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供的BL410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定，由專人操作。腹腔注射麻醉后，打開腹腔暴露門靜脈主干，于腸系膜前靜脈右側(cè)靠近門靜脈處分離出一回腸腸系膜靜脈分支，結(jié)扎其遠(yuǎn)端，然后用血管剪剪開一適宜缺口，將PE100導(dǎo)管自缺口插入后，沿腸系膜前靜脈上行，通過脾靜脈至門靜脈主干，固定導(dǎo)管并接通壓力換能器測量門靜脈壓力。

1.2.5 IGFBP-2檢測 采用酶聯(lián)免疫試劑盒測定，用雙抗體夾心ABC-ELISA法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用ANOVA單因素方差分析，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 組織病理改變 根據(jù)病理切片的HE染色與Masson三色染色結(jié)果(見圖1)，正常對照組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索排列規(guī)則有序;模型組隨造模時(shí)間的延長，肝纖維化程度逐漸加重，肝細(xì)胞水腫加重，出現(xiàn)氣球樣變，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度脂肪變;匯管區(qū)及周圍炎癥范圍擴(kuò)大，可見不同程度碎屑?jí)乃溃准?xì)胞形成橋樣連接，中央靜脈周圍及匯管區(qū)膠原纖維與網(wǎng)狀纖維沉積增多并向外延伸，形成纖維間隔，至8周末，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，大量纖維包繞增生的肝組織形成假小葉，甚至部分到達(dá)早期肝硬化階段。

圖1 各組肝組織病理變化(Masson三色染色，×100)Fig 1 Pathological changes in normal rats and liver fibrosis rats(Masson staining，×100)

應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)顯示，模型組2周肝臟總膠原沉積與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表1)。模型組4周肝臟總膠原沉積較正常對照組明顯增加(P＜0.01)。隨著造模時(shí)間的延長，模型組肝臟總膠原沉積增加更明顯，顯著高于正常對照組(P＜0.01，見表1)。

表1大鼠各時(shí)間肝組織膠原纖維面積百分比、ALT、門靜脈壓、血清IGFBP-2的動(dòng)態(tài)變化(±s)Tab 1 The dynamic changes of the collagen fiber area percentage，ALT，portal vein pressure，IGFBP-2 in fibrotic rat liver(±s)

表1大鼠各時(shí)間肝組織膠原纖維面積百分比、ALT、門靜脈壓、血清IGFBP-2的動(dòng)態(tài)變化(±s)Tab 1 The dynamic changes of the collagen fiber area percentage，ALT，portal vein pressure，IGFBP-2 in fibrotic rat liver(±s)

與正常對照組的比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n 肝臟膠原面積百分比 ALT/(U/L) 門靜脈壓/mmHg IGFBP-2水平/(μg/L)正常對照組 6 0.018 ±0.014 25.20 ±6.42 4.65 ±0.55 12.64 ±1.93模型組 2 周 6 0.024 ±0.016 23.80 ±4.97 8.43 ±0.86* 15.87 ±1.17＊＊4 周 6 0.210 ±0.031＊＊ 51.60 ±8.26* 12.26 ±1.31* 21.07 ±1.47＊＊6 周 6 0.310 ±0.037＊＊ 109.80 ±33.66＊＊ 15.03 ±2.29＊＊ 30.06 ±2.37＊＊8 周 6 0.390 ±0.036＊＊ 139.80 ±38.88＊＊ 16.22 ±2.08＊＊ 40.72 ±1.28＊＊

2.2 大鼠肝功能的變化 從表1可看出，模型組大鼠4周肝功能ALT水平較正常對照組高(P＜0.05)，隨著動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行及肝纖維化的形成和發(fā)展，ALT水平逐漸增加，顯著高于正常對照組(P＜0.01)。

2.3 大鼠門靜脈壓的變化 模型組大鼠2周門靜脈壓水平就較正常對照組高(P＜0.05)，而且隨著動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行及肝纖維化的形成和發(fā)展，門靜脈壓水平逐漸增高，顯著高于正常對照組(P＜0.01，見表1)。

2.4 大鼠血清中IGFBP-2的變化 由表1可知，模型組大鼠第2、4、6、8周IGFBP-2水平較正常對照組明顯增加(P＜0.01)。且隨著肝纖維化的進(jìn)展，血清IGFBP-2水平逐漸增高。

2.5 模型組大鼠血清IGFBP-2水平與肝纖維化程度相關(guān)性分析 肝纖維化的程度可以用肝臟膠原面積比定量表示，將模型組大鼠肝臟膠原面積比與模型組血清 IGFBP-2進(jìn)行相關(guān)性分析，得出r=0.874 2，表明肝纖維化程度與血清IGFBP-2水平呈正相關(guān)(P＜0.001)。

3 討論

肝星狀細(xì)胞是膠原纖維的主要來源，是肝纖維化形成的重要因素。激活的肝星狀細(xì)胞通過自分泌和旁分泌產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，在肝纖維化的發(fā)生中起重要作用，這些細(xì)胞因子包括轉(zhuǎn)化生長因子、血小板衍生因子及胰島素樣生長因子等［3］。血液中的IGFBP-2主要由肝組織產(chǎn)生釋放［4］，它是對胰島素樣生長因子(IGF)的活性起調(diào)節(jié)作用的重要蛋白，IGF在血液和組織液中不是游離存在而是與IGFBP高親和以復(fù)合物的形式存在，血清IGFBP-2通過對IGFs作用的調(diào)節(jié)而在肝纖維化的形成中發(fā)揮重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，測定血清IGFBP-2的動(dòng)態(tài)變化，明確血清IGFBP-2與肝纖維化的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠隨著肝纖維化程度的加重，門靜脈壓力增高，IGFBP-2水平增高。進(jìn)一步對血清IGFBP-2水平與肝纖維化程度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示血清IGFBP-2水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)(P＜0.01)，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［5，6］。體外培養(yǎng)肝細(xì)胞受損時(shí)，肝細(xì)胞IGFBP-2的表達(dá)和分泌顯著增強(qiáng)。推測IGFBP-2參與了肝細(xì)胞的損傷過程［7］?？莘窦?xì)胞與肝細(xì)胞共同培養(yǎng)可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成IGFBP-2增多［8］。激活的星狀細(xì)胞可表達(dá)和分泌IGFBP-2。TGF-β1可刺激星狀細(xì)胞表達(dá)和產(chǎn)生IGFBP-2，TGF-β1與肝纖維化關(guān)系密切，因此IGFBP-2參與了肝纖維化的發(fā)展［9］。

綜上所述，隨著肝纖維化程度的加重，門脈壓力增高，血清IGFBP-2逐漸增加，IGFBP-2在肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

［1］ 方宏才，李威.胰島素樣生長因子Ⅰ受體和腫瘤的關(guān)系［J］.廣東醫(yī)學(xué)雜志，2007，28(9):1530－1532.

［2］ 吳琛，徐東剛，王嘉璽.胰島素樣生長因子研究進(jìn)展［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院刊，2006，30(5):476－479.

［3］ 申鳳俊，陰赪宏，王寶恩.腎素血管緊張素系統(tǒng)與肝纖維化、肝硬化［J］.中華肝臟病雜志，2003，11(7):447－448.

［4］ Schwander JC，Hauri C，Zapf J，et al.Synthesis and secretion of insulin-like growth factor and its binding protein by the perfused rat liver:dependence on growth hormone status［J］.Endocrinology，2010，113:297－305.

［5］ 巴明臣，崔書中，唐云強(qiáng)，等.IGF-11和IGFBP-2在原發(fā)性肝癌患者血清的表達(dá)及其對外科治療效果的評(píng)價(jià)［J］.中華普通外科雜志，2010，25(7):583－584.

［6］ 崔書中，巴明臣，呂嘉春，等.IGF-Ⅱ、IGFBP-2在肝癌患者血清的表達(dá)及其對評(píng)價(jià)經(jīng)皮肝動(dòng)脈化療栓塞治療效果的意義［J］.中華肝膽外科雜志，2010，16(4):245－248.

［7］ 劉立新，孫凌云，郭曉紅，等.胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2，4在實(shí)驗(yàn)性肝細(xì)胞損傷中的表達(dá)及意義［J］.中國病理生理雜志，2009，25(1):137－143.

［8］ Scharf JG，Ramadori G，Braulke T，et al.Synthesis of insulin-like growth factor binding proteins and of the acid-labile subunit in primary cultures of rat hepatocytes，of Kupfer cells，and in cocuhures:regulation by insulin，insulin-like growth factor，and growth hormone［J］.Hepatology，2003，23(6):818－827.

［9］ 劉立新，張騫騫，韓德五，等.IGFBP2、IGFBP6在 TGF-β1活化的肝星狀細(xì)胞中表達(dá)［J］.中國病理生理雜志，2008，24(12):2481－2483.