紅酵母細(xì)胞通透性研究

李永紅， 朱登勇， 王 姣， 侯立芬， 劉宏民

(1.鄭州大學(xué) 新藥研究開(kāi)發(fā)中心 河南 鄭州 450001； 2.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001；3.鄭州大學(xué) 化學(xué)系 河南 鄭州 450001)

紅酵母細(xì)胞通透性研究

李永紅1,2， 朱登勇3， 王 姣3， 侯立芬3， 劉宏民1,2

(1.鄭州大學(xué) 新藥研究開(kāi)發(fā)中心 河南 鄭州 450001； 2.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001；3.鄭州大學(xué) 化學(xué)系 河南 鄭州 450001)

用插入式超聲、反復(fù)凍融和有機(jī)溶劑法對(duì)細(xì)胞通透性進(jìn)行處理.結(jié)果表明，在超聲功率為750 W，超聲時(shí)間3 s和間隔時(shí)間4 s的條件下，超聲處理75次效果最佳；加入甲苯、氯仿和正己烷等有機(jī)溶劑均可提高細(xì)胞通透性，其中甲苯的效果最好.

紅酵母； 細(xì)胞通透性； 超聲； 反復(fù)凍融； 有機(jī)溶劑

0 引言

在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，如果所用的酶是胞內(nèi)酶，細(xì)胞的通透性在很大程度上影響轉(zhuǎn)化率.改變細(xì)胞膜的通透性有利于代謝產(chǎn)物在細(xì)胞外(培養(yǎng)基中) 的累積，使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行.

用固定化細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化具有顯著的優(yōu)越性.但固定化以后，細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用，增大細(xì)胞膜通透性可以減小細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的擴(kuò)散限制作用，提高轉(zhuǎn)化速度.常用于改變細(xì)胞通透性的方法有超聲法、反復(fù)凍融法和有機(jī)溶劑法[1-8].

作者在實(shí)驗(yàn)中篩選到一株能產(chǎn)生立體選擇性脂肪酶的紅酵母[9]，利用其建立了生物拆分法制備S-倍他洛爾的新工藝[10]，并對(duì)細(xì)胞固定化進(jìn)行研究，為了提高固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化速率，需要對(duì)細(xì)胞的通透性進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1儀器

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)JY92-Π型(寧波新芝科器研究所)，恒溫?fù)u瓶柜HYG-Ⅱa型(上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司)，薄層掃描色譜儀CS-930型(島津公司)，YJ超凈工作臺(tái)(蘇州市潔凈工作研究所)，pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，Syltech 500高效液相色譜儀(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司)，Chiralcel OJ-H色譜柱(Dicel 公司).

1.2材料與試劑

菌種為本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏的一株膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198.

玉米漿由安陽(yáng)第一制藥廠(chǎng)提供；氯仿、乙酸乙酯由工業(yè)品重蒸得到；瓊脂粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、丙酮及其他試劑均為分析純.

1.3細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)基配方為：蛋白胨為0.2%，玉米漿為2%，甘油為3%，pH 5.7.接種后于32 ℃，210 r/min培養(yǎng)40 h.

1.3.2超聲處理[7]將紅酵母細(xì)胞分裝入錐形瓶中，加入已滅菌的pH 6.0緩沖溶液，用不同超聲功率及不同超聲次數(shù)(超聲條件：超聲時(shí)間3 s，間隔時(shí)間4 s)進(jìn)行處理(超聲處理在冰水浴中進(jìn)行).以不作任何處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照.

1.3.3反復(fù)凍融處理[4-5]將紅酵母細(xì)胞置于冰箱中-85 ℃凍存10 min，取出，30 ℃水浴融化，反復(fù)凍融三次，置于冰箱4 ℃保存.以不作任何處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照.

1.4生物轉(zhuǎn)化

1.4.1水相中轉(zhuǎn)化 在處理好的細(xì)胞懸液中加入3 g/L的底物，于28 ℃，210 r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)化，間隔一定時(shí)間取樣.

1.4.2兩相體系中轉(zhuǎn)化 將緩沖液分裝到三角瓶中，滅菌后加入3 g/L底物及適量有機(jī)溶劑，將離心過(guò)的細(xì)胞平均分至各瓶，于28 ℃，210 r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)化.

1.5轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用TLC[11]和HPLC[12]方法進(jìn)行分析.改變細(xì)胞通透性是為了增大底物的轉(zhuǎn)化速率，所以用轉(zhuǎn)化率來(lái)判斷細(xì)胞通透性的好壞.轉(zhuǎn)化率高即表示細(xì)胞通透性好.

1.5.1轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取 用等體積的乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液三次，將乙酸乙酯相用飽和NaHCO3溶液洗三次，飽和NaCl溶液洗三次，再用蒸餾水洗一次.飽和NaHCO3相和飽和NaCl相用乙酸乙酯反萃取一次.合并有機(jī)相，用無(wú)水Na2SO4干燥后用于HPLC法測(cè)定.

1.5.2轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的測(cè)定 采用HPLC方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物濃度，以手性Chiralcel OJ-H柱為固定相，正己烷-異丙醇(體積比85∶15)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm.并在此基礎(chǔ)上計(jì)算轉(zhuǎn)化率.由于化合物Ⅱ是目標(biāo)產(chǎn)物(圖1)，所以以化合物Ⅱ的量占加入底物量的百分率來(lái)表示轉(zhuǎn)化率.

圖1 藥物中間體拆分原理示意圖Fig.1 Scheme of drug intermediate resolution

生物轉(zhuǎn)化和其他酶促反應(yīng)一樣符合米氏曲線(xiàn)，所以，應(yīng)該研究在米氏曲線(xiàn)上處于一級(jí)反應(yīng)階段時(shí)的轉(zhuǎn)化率，因此在研究超聲影響時(shí)選擇轉(zhuǎn)化30 min時(shí)的轉(zhuǎn)化率.而研究有機(jī)溶劑影響時(shí)由于反應(yīng)體系不同，也對(duì)不同體系的轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)進(jìn)行了研究.

2 結(jié)果與討論

圖2 不同條件超聲處理細(xì)胞的轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)Fig.2 Conversion by cells treated by different ultrasonic conditions

2.1插入式超聲對(duì)細(xì)胞通透性的影響

不同條件超聲處理后的轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖2所示.

由圖2可以看出，功率為400 W時(shí)，超聲60和75次時(shí)轉(zhuǎn)化率較高，與空白對(duì)照相當(dāng)；功率為500 W時(shí)，超聲75次轉(zhuǎn)化率比空白對(duì)照高，90次時(shí)與空白對(duì)照相當(dāng)；功率為600 W時(shí)，超聲次數(shù)從60次開(kāi)始，轉(zhuǎn)化率都要比空白對(duì)照高；功率為750 W時(shí)，超聲60次以上轉(zhuǎn)化率都要比空白對(duì)照好，超聲75次已明顯高于空白對(duì)照.結(jié)論：隨著超聲次數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化率呈先升后降的趨勢(shì)，超聲75次時(shí)轉(zhuǎn)化率最高；隨超聲功率的增加，轉(zhuǎn)化率呈不斷增加的趨勢(shì)(見(jiàn)表1).

表1 超聲次數(shù)為75次時(shí)各個(gè)功率下的轉(zhuǎn)化率

產(chǎn)生上述結(jié)果的可能原因是：①功率相同時(shí)，超聲處理次數(shù)不同使細(xì)胞受損產(chǎn)生的滲漏程度以及酶活性受到的影響不同.隨著超聲次數(shù)增多，酶蛋白活性受損，但細(xì)胞通透性提高，這兩種作用對(duì)轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生相反的影響，處理75次轉(zhuǎn)化率最高是這兩種因素共同作用的結(jié)果.②酵母菌為真菌，細(xì)胞壁比較堅(jiān)韌，必須在大功率條件下才能達(dá)到較好的滲漏效果，因此本研究中在750 W功率下效果最明顯，如果提高功率效果可能更好.

2.2有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞通透性的影響

研究有機(jī)溶劑的影響需要以水相中的轉(zhuǎn)化結(jié)果為參照.水相中的轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)如圖3所示.由圖3可知，反應(yīng)體系中沒(méi)有加入有機(jī)溶劑時(shí)轉(zhuǎn)化速度很慢，最高速率為0.075/h，反應(yīng)6 h達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率45%.

2.2.1氯仿對(duì)轉(zhuǎn)化的影響 在氯仿-水雙相體系中轉(zhuǎn)化時(shí)的轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)如圖4.由圖4可知，反應(yīng)體系中加入氯仿后，最高轉(zhuǎn)化速率為0.078/h，反應(yīng)3 h轉(zhuǎn)化率達(dá)到56%，以后隨時(shí)間變化不明顯.

圖3 水相中的轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)Fig.3 Conversion in aqueous phase

圖4 在氯仿-水雙相體系中的轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)Fig.4 Conversion in aqueous-chloroform double phase

2.2.2正己烷對(duì)轉(zhuǎn)化的影響 正己烷-水雙相體系中的轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)如圖5.由圖5可以看出，反應(yīng)體系中加入正己烷后，反應(yīng)3 h轉(zhuǎn)化率基本達(dá)到最大值61%，最高速率為0.058/h.

2.2.3甲苯對(duì)轉(zhuǎn)化的影響 甲苯-水雙相體系中的轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)如圖6.由圖6可知,反應(yīng)體系中加入甲苯后，反應(yīng)1 h產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率就達(dá)到66%，最高速率為0.27/h.這是由于加入甲苯后細(xì)胞的通透性發(fā)生改變，酶與底物可以充分接觸，從而提高了底物的轉(zhuǎn)化速率.

由圖3～6可以看出：體系中不加有機(jī)溶劑，反應(yīng)速度很慢，加入有機(jī)溶劑能夠使反應(yīng)效率迅速提高，其中甲苯效果最好.表2為不同體系的轉(zhuǎn)化效果比較.

圖5 在正己烷-水雙相體系中的轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)Fig.5 Conversion in aqueous-hexane double phase

圖6 在甲苯-水雙相體系中的轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)Fig.6 Conversion in aqueous-toluene double phase

表2 各溶劑中底物的最高轉(zhuǎn)化速率

進(jìn)一步對(duì)甲苯用量進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖7.由圖7可知，甲苯加入量小于15%時(shí)，轉(zhuǎn)化速率隨甲苯量的增加而提高；當(dāng)加入量大于15%時(shí)，影響不明顯.

圖7 體系中甲苯含量對(duì)轉(zhuǎn)化的影響Fig.7 Effect of toluene content on conversion

2.3反復(fù)凍融對(duì)細(xì)胞通透性的影響

細(xì)胞反復(fù)凍融三次后，轉(zhuǎn)化結(jié)果和空白幾乎相同.

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)對(duì)不同方法的研究得出以下結(jié)論：

1)超聲處理能提高細(xì)胞通透性.隨著超聲次數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化率呈先升后降的趨勢(shì)，超聲75次時(shí)轉(zhuǎn)化率最高；功率小于750 W時(shí)效果隨功率的增加而提高.

2)反復(fù)凍融對(duì)細(xì)胞通透性的影響不明顯.

3)甲苯、氯仿、正己烷等有機(jī)溶劑均可提高細(xì)胞的通透性，其中甲苯的效果最好.

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StudyontheCellularPermeabilityofRhodotorula

LI Yong-hong1,2, ZHU Deng-yong3, WANG Jiao3, HOU Li-fen3, LIU Hong-min1,2

(1.NewDrugResearch&DevelopmentCenter,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China;2.SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China;3.DepartmentofChemistry,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

Probe ultrasound,repeated freeze thawing and organic solvents were used to increase cellular permeability. It was discovered that the best result was obtained with supersonic power 750 W,supersonic time 3 s,time interval 4 s,and the supersonic times 75. Toluene,chloroform and n-hexane could increase cellular permeability,with toluene the best.

rhodotorula;cellular permeability;ultrasonic;repeated freeze-thaw;organic solvent

Q 932

A

1671-6841(2011)04-0100-04

2010-12-08

李永紅(1970-)，女，副教授，博士，主要從事生物學(xué)研究，E-mail:lyh224@163.com；通訊作者：劉宏民(1960-)，男，教授，博士，主要從事藥物化學(xué)研究，E-mail:liuhm@zzu.edu.cn.