微小RNA在胰腺導(dǎo)管腺癌中的研究進(jìn)展

余春開(kāi)，于雙妮，盧朝輝，陳 杰

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院病理科, 北京 100730

·綜述·

微小RNA在胰腺導(dǎo)管腺癌中的研究進(jìn)展

余春開(kāi)，于雙妮，盧朝輝，陳 杰

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院病理科, 北京 100730

微小RNA (miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼RNA分子，長(zhǎng)度19～24個(gè)核苷酸，作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)分子發(fā)揮作用。多種腫瘤中都存在miRNA表達(dá)譜的改變，差異表達(dá)的miRNA發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著密切的聯(lián)系。對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌miRNA表達(dá)譜的研究及其靶基因的探索有助于了解胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)miRNA表達(dá)譜是胰腺導(dǎo)管腺癌早期診斷和預(yù)后判斷潛在的腫瘤標(biāo)志物。本文總結(jié)了近年已知miRNA在胰腺腺癌中的表達(dá)情況，并探討miRNA在胰腺導(dǎo)管腺癌診斷、治療及預(yù)后中的作用。

胰腺導(dǎo)管腺癌；微小RNA；靶基因；生物學(xué)標(biāo)志物

胰腺導(dǎo)管腺癌是一種高度侵襲性的腫瘤，且臨床癥狀出現(xiàn)晚，不易早期發(fā)現(xiàn)，是實(shí)性腫瘤中預(yù)后最差的，5年生存率小于5%。在美國(guó)，胰腺導(dǎo)管腺癌在癌癥導(dǎo)致的死亡原因中排第4位。在我國(guó)發(fā)病率逐年上升，且有年輕化的趨勢(shì)。雖然化療和放療等輔助治療對(duì)于延長(zhǎng)胰腺導(dǎo)管腺癌患者生存時(shí)間發(fā)揮了一定作用，但是預(yù)后仍然很差，中位生存期小于24個(gè)月。目前幾乎沒(méi)有胰腺導(dǎo)管腺癌特異性的生物學(xué)標(biāo)記，也沒(méi)有滿(mǎn)意的胰腺導(dǎo)管腺癌的診斷和治療方法。胰腺導(dǎo)管腺癌微小RNA(microRNA, miRNA)的研究有助于了解胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)病機(jī)制，并可能為胰腺導(dǎo)管腺癌的診斷和治療提供新線索。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度19～24個(gè)核苷酸，通過(guò)與mRNA 特定區(qū)域結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯進(jìn)行調(diào)控。在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前已報(bào)道1000多種人類(lèi)miRNA，其中一部分miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡和分化中發(fā)揮作用。多種腫瘤中存在miRNA表達(dá)譜的改變，miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著密切的聯(lián)系。近年研究表明，miRNA 在人類(lèi)胰腺導(dǎo)管腺癌組織中有異常表達(dá)，其表達(dá)譜可清楚區(qū)分癌組織與慢性胰腺炎及正常胰腺組織[1-12]。有研究顯示miRNA 在人外周血中穩(wěn)定表達(dá)，提示miRNA 是胰腺導(dǎo)管腺癌早期診斷潛在的腫瘤標(biāo)記物[1]。另有研究者發(fā)現(xiàn)了一些胰腺導(dǎo)管腺癌相關(guān)miRNA作用的靶基因，提示miRNA可能是胰腺導(dǎo)管腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

miRNA的結(jié)構(gòu)和生物合成

miRNA由不同的染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而成，編碼miRNA的基因約占整個(gè)基因組的2%～5%。miRNA的生物合成較為復(fù)雜[2-3]，首先miRNA基因由RNA 合酶Ⅱ介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄成初級(jí)-miRNA(primary miRNA)，其含有帽子結(jié)構(gòu)和poly A 尾。初級(jí)-miRNA在核內(nèi)被核糖核酸酶Ⅲ家族成員Drosha剪切成約70核苷酸 具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的前體-miRNA(precursor miRNA)。與雙鏈RNA 結(jié)合蛋白DGCR8結(jié)合，前體-miRNA由核輸出蛋白-5和RAN 2GTP轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)，被另一種核糖核酸酶Ⅲ家族成員Dicer剪切為長(zhǎng)約22核苷酸的雙鏈miRNA。miRNA 雙體經(jīng)過(guò)解旋酶的作用解旋，產(chǎn)生成熟miRNA單體，其中具有生物學(xué)作用的一條單鏈成熟miRNA很快和RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物進(jìn)行組合，而另一條鏈大部分情況下被降解。在RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物的保護(hù)下，miRNA與靶mRNA的3’端非編碼區(qū)相結(jié)合[4]。

miRNA與腫瘤

研究表明miRNA 在人體一系列重要的生命過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化和炎癥等。人體中20%～30%的蛋白編碼基因被miRNA 調(diào)控，miRNA與相應(yīng)的基因和蛋白質(zhì)一起形成人體復(fù)雜而精確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究證實(shí)多種腫瘤組織都存在miRNA表達(dá)譜的改變，miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著密切的聯(lián)系。與正常組織相比，腫瘤組織存在差異性表達(dá)，有部分miRNA表達(dá)上調(diào)，部分miRNA表達(dá)下調(diào)。Volinia等[5]運(yùn)用含有特異性探針的芯片對(duì)54 個(gè)樣本(包括肺、乳腺、胃、前列腺、結(jié)腸和胰腺癌6 種實(shí)體瘤組織)的137個(gè)miRNA 表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有49個(gè)miRNA 差異表達(dá)，其中34個(gè)miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)高于其在正常組織中的表達(dá)。

與腫瘤相關(guān)的微小RNA，被稱(chēng)為致癌微小RNA。miRNA表達(dá)的改變可發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。若在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，具有類(lèi)似癌基因的作用；在腫瘤組織中低表達(dá)時(shí)，則具有類(lèi)似腫瘤抑制因子的作用。

胰腺導(dǎo)管腺癌中miRNA的表達(dá)譜

胰腺導(dǎo)管腺癌是多基因參與的高度惡性腫瘤，且這些多基因改變參與了胰腺導(dǎo)管腺癌從胰腺癌前病變到胰腺導(dǎo)管腺癌的不同發(fā)展過(guò)程。胰腺癌前病變包括胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤、黏液性囊腺瘤及胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)。胰腺癌前病變可能存在不同的miRNA表達(dá)譜[6-8]。Habbe等[6]用qRT-PCR和核酸鎖定原位雜交的方法檢測(cè)15例胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤及對(duì)應(yīng)的對(duì)照組織發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)顯著上調(diào)。Ryu等[7]分析了miR-21、 miR-155和miR-221在胰腺非浸潤(rùn)性病變(PanIN-1、PanIN-2和 PanIN-3)的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-155表達(dá)上調(diào)出現(xiàn)在PanIN-2，而miR-21表達(dá)上調(diào)出現(xiàn)在PanIN-3。這些研究結(jié)果均提示miR-155表達(dá)異常出現(xiàn)在胰腺導(dǎo)管腺癌的較早期階段，miR-155可作為胰腺癌前病變的生物學(xué)標(biāo)記物。

近幾年miRNA芯片和定量PCR技術(shù)被應(yīng)用于miRNA的研究。有學(xué)者用這些技術(shù)研究胰腺導(dǎo)管腺癌的miRNA表達(dá)譜，比較胰腺導(dǎo)管腺癌來(lái)源的細(xì)胞系或胰腺導(dǎo)管腺癌組織與慢性胰腺炎、正常胰腺組織的miRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示胰腺導(dǎo)管腺癌中有大量的miRNA表達(dá)出現(xiàn)異常[9-12]。與正常胰腺組織相比，胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系或癌組織中miRNA的表達(dá)異常大部分表現(xiàn)為高表達(dá)，如miR-21、miR-155、miR-221、miR-210等，小部分為低表達(dá)，如miR-148a/-148b；并且發(fā)現(xiàn)慢性胰腺炎miRNA的表達(dá)譜與正常胰腺組織相似，而胰腺正常組織與胰腺導(dǎo)管腺癌的miRNA表達(dá)譜則明顯不同[9-12]。

由于腫瘤組織標(biāo)本中包含了腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)、正常腺泡及導(dǎo)管等各種類(lèi)型細(xì)胞，因此由整個(gè)腫瘤組織檢測(cè)到的miRNA不能直接反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的miRNA改變。用核酸鎖定原位雜交方法可以明確定位哪種細(xì)胞出現(xiàn)了miRNA表達(dá)改變。研究顯示大部分miRNA如miR-21和miR-155的過(guò)表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞，而不是間質(zhì)、正常腺泡或?qū)Ч躘6, 13]；另有報(bào)道m(xù)iR-221、 miR-376a及miR-301的表達(dá)亦定位于腫瘤細(xì)胞，而間質(zhì)、正常腺泡或?qū)Ч軣o(wú)表達(dá)[9]。

miRNA與靶基因

根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，一種miRNA 可調(diào)控多種靶mRNA的表達(dá)，而一個(gè)靶mRNA可以接受多個(gè)miRNA 的調(diào)控。miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，通過(guò)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄體的切割或?qū)ζ浞g抑制等兩種機(jī)制來(lái)下調(diào)靶基因的表達(dá)。這兩種機(jī)制的選擇取決于其與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度。如果miRNA 與靶基因轉(zhuǎn)錄體mRNA 充分互補(bǔ)，miRNA 將通過(guò)切割方式降解靶基因；如果miRNA與靶基因轉(zhuǎn)錄體mRNA未充分互補(bǔ), 但有多個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)，那么miRNA 將對(duì)靶基因進(jìn)行翻譯抑制[14]。miRNA對(duì)其功能靶點(diǎn)的最低要求是至少7個(gè)堿基與5’端互補(bǔ)結(jié)合，即可調(diào)控其靶基因。

近年陸續(xù)有關(guān)于胰腺導(dǎo)管腺癌miRNA的功能研究及其靶基因的報(bào)道(表1)。但是由于miRNA與靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，特別是胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用的miRNA與靶基因仍需要大量的研究進(jìn)一步證實(shí)。

miRNA與胰腺導(dǎo)管腺癌的診斷

胰腺導(dǎo)管腺癌組織存在miRNA的異常表達(dá)，而且miRNA的差異表達(dá)有胰腺的組織特異性，因此miRNA可用于胰腺導(dǎo)管腺癌與其他臟器組織來(lái)源惡性腫瘤的鑒別診斷[10, 41-42]。Poy等[43]研究顯示miR-375和miR-376在鼠胰腺和胰腺細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于鼠的腦、心臟和肝組織。Olson等[44]檢測(cè)了540例實(shí)性腫瘤(包括乳腺、結(jié)腸、肺、胰腺、前列腺和胃)的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)不同實(shí)性腫瘤及正常細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜有差異，miR-21、miR-191和 miR-17-5p在所有6種類(lèi)型腫瘤均顯著過(guò)表達(dá)，而miR-218-2在結(jié)腸、胃、前列腺和胰腺均低表達(dá)，在肺癌和乳腺癌未出現(xiàn)低表達(dá)，這些結(jié)果表明結(jié)腸、胰腺、前列腺和肺具有相似的miRNA表達(dá)，而乳腺和肺分別有不同的miRNA表達(dá)。胰腺內(nèi)分泌和外分泌腫瘤的miRNA的表達(dá)亦存在差異，如miR-204主要在胰島素瘤中表達(dá)，且與其免疫組化胰島素的表達(dá)有相關(guān)性，miRNA可用于鑒別內(nèi)分泌腫瘤和腺泡來(lái)源的腫瘤[45]。

表 1 胰腺導(dǎo)管腺癌相關(guān)微小RNA的功能及其靶基因

相對(duì)于幾萬(wàn)種mRNA和蛋白的表達(dá)譜，只有幾百種的miRNA表達(dá)譜可能是一種更好的鑒別診斷方法[46]。另外miRNA分子比mRNA要短，更能耐受核糖核酸酶的降解，且在福爾馬林固定石蠟包埋組織和血漿中能完整的保存，因此石蠟包埋組織和外周血也可用于胰腺導(dǎo)管腺癌miRNA的研究和診斷[10, 46-47]。Ho等[32]對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌患者和正常人的外周血miR-210的對(duì)照研究顯示，miR-210能被有效的檢測(cè)到并定量，并且發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌患者和正常人的外周血 miR-210 的表達(dá)有顯著性差異。另外還發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌患者胰液與腫瘤組織中有相似的miRNA表達(dá)改變[48]。由此推測(cè)miRNA可作為胰腺導(dǎo)管腺癌的診斷性篩查和預(yù)后監(jiān)測(cè)。

雖然miRNA用于胰腺導(dǎo)管腺癌的臨床診斷還需要大量的研究工作，但是目前的研究結(jié)果表明miRNA表達(dá)譜是潛在的診斷標(biāo)記物。

miRNA與胰腺導(dǎo)管腺癌的治療

miRNA在腫瘤中可以發(fā)揮癌基因和抑癌基因的作用，因此產(chǎn)生了兩種以miRNA為基礎(chǔ)的腫瘤治療新策略：即恢復(fù)腫瘤中低表達(dá)的miRNA及阻斷腫瘤中過(guò)表達(dá)的miRNA。關(guān)于miRNA功能研究的體外和體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)人工合成miRNA或其反義寡核苷酸可影響癌基因及抑癌基因的表達(dá)、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力和腫瘤的生長(zhǎng)速度[13,18,36,38-40]。

合成miRNA、修正miRNA低表達(dá)將是一種新的腫瘤治療方法[37]。let-7在正常胰腺腺泡中高表達(dá)而在低分化癌細(xì)胞中表達(dá)缺失，體外修復(fù)胰腺導(dǎo)管腺癌中l(wèi)et-7的表達(dá)水平，獲取胞漿合成let-7的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染慢病毒載體，結(jié)果在體外和體內(nèi)對(duì)細(xì)胞增生、K-ras的表達(dá)和有絲分裂蛋白激酶活性有較強(qiáng)的抑制作用[36]。hsa-mir-217在胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)下調(diào)，采用構(gòu)建的hsa-mir-217表達(dá)載體、人工合成前體pre-mir-217和抑制劑anti-mir-217對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示升高h(yuǎn)sa-mir-217可以顯著抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系PANC-1及MIA PaCa-2細(xì)胞生長(zhǎng)及非錨著依賴(lài)性生長(zhǎng)能力；217-載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤模型結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，217-載體轉(zhuǎn)染組移植瘤的生長(zhǎng)速度顯著減慢；轉(zhuǎn)染217-抑制劑的MIA PaCa-2細(xì)胞內(nèi)源性hsa-mir-217水平降低而非錨著依賴(lài)性生長(zhǎng)能力增強(qiáng)[13]。

另外，miRNA的反義寡核苷酸在體內(nèi)能抑制miRNA的功能。合成腫瘤組織中高表達(dá)miRNA或其前體的反義寡核苷酸可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)速度。反義寡核苷酸包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基的膽固醇分子偶聯(lián)的寡聚核苷酸或鎖定核苷酸的寡核苷酸。

miRNA與胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后

miRNA的表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后是否存在一定的相關(guān)性？如果確實(shí)有某些miRNA的表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后有相關(guān)性，那么miRNA可以作為一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo)，并確定哪些患者需要進(jìn)一步的治療。miR-21是目前研究較多的可能與胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后密切相關(guān)的miRNA[15, 17, 49]。Dillhoff等[16]用原位雜交的方法證實(shí)miR-21的表達(dá)與胰腺腫瘤大小、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和臨床分期無(wú)相關(guān)性，但是與miR-21局灶表達(dá)或無(wú)表達(dá)且淋巴結(jié)陰性的患者相比，miR-21過(guò)表達(dá)的患者預(yù)后更差。Bloomston等[10]比較了存活超過(guò)2年的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者和2年內(nèi)死亡的患者的miRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而生存期長(zhǎng)的患者有6個(gè)miRNA (miR-452、miR-105、miR-127、miR-518a-2、 miR-187、和miR-30a-3p)高表達(dá)；另外研究顯示miR-196-a2的高表達(dá)與預(yù)后差存在相關(guān)性。Greither等[21]用定量RT-PCR的方法檢測(cè)56例胰腺癌miRNA表達(dá)情況并分析了與預(yù)后隨訪相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-155、 miR-203、miR-210和miR-222與預(yù)后差存在顯著的相關(guān)性，與表達(dá)下調(diào)的患者相比，這4個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增高6.2倍[21]。另外miR-17-5p[50]和hsa-miR-200c[51]也可能與胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后差有關(guān)。

miRNA在外周血中穩(wěn)定存在，因此，外周血miRNA是胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后隨訪潛在的生物學(xué)標(biāo)記物。Kong 等[52]用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了35例胰腺導(dǎo)管腺癌、15例慢性胰腺炎和15例正常人血清miRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示血清miR-21可以區(qū)別胰腺癌患者和正常人，血清miR-155 和 miR-196a可以區(qū)別胰腺疾病患者和正常人，而非手術(shù)患者的血清miR-196a比手術(shù)患者明顯高，而且高表達(dá)的患者預(yù)后明顯差。

結(jié) 語(yǔ)

miRNA 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著密切的聯(lián)系。miRNA的功能研究及在胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療中的作用，已成為胰腺導(dǎo)管腺癌研究的熱點(diǎn)。有研究表明胰腺導(dǎo)管腺癌存在miRNA異常表達(dá)，并且部分miRNA可能具有胰腺特異性，但是尚未明確是哪個(gè)或哪幾個(gè)miRNA在胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且其調(diào)控的靶基因及調(diào)控機(jī)制尚需做大量的研究工作，而其在胰腺導(dǎo)管腺癌診斷、治療及預(yù)后上的研究尚處于初步階段，還不能廣泛地應(yīng)用于臨床。希望胰腺導(dǎo)管腺癌miRNA的研究能進(jìn)一步剖析胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)病機(jī)制，并為胰腺導(dǎo)管腺癌的臨床診斷和預(yù)后隨訪提供特異、敏感的分子生物標(biāo)志物，為胰腺導(dǎo)管腺癌的治療研究提供新視野。

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ResearchAdvancesinMicroRNAinPancreaticDuctalAdenocarcinoma

YU Chun-kai, YU Shuang-ni, LU Zhao-hui, CHEN Jie

Department of Pathology, PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

CHEN Jie Tel:010-65295490, E-mail: xhblk@163.com

MicroRNA (miRNA), small non-coding RNA consisted of 19-24 nucleotides, are able to regulate gene expression at the post-transcriptional level. The aberrant expressions of miRNA have been found in various cancers and contribute to carcinogenesis by promoting the expression of proto-oncogenes or by inhibiting the expression of tumor suppressor genes. miRNA are related closely with the oncogenesis, progression, and prognosis of tumors. The discovery of the aberrant expression of miRNA in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) and its target genes are helpful for the understanding of the pathogenesis of PDA and for the early diagnosis and prediction of this disease. In this paper, we summarize the recent research advances in miRNA expression in PDA and its target genes and discuss the potential role of miRNA in the diagnosis, and treatment of PDA.

pancreatic ductal adenocarcinoma; microRNA；target gene; biomarker

ActaAcadMedSin, 2011,33(5):575-581

陳 杰 電話：010-65295490，電子郵件：xhblk@163.com

R735.9

A

1000-503X(2011)05-0575-07

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.05.019

國(guó)家自然科學(xué)基金(30471970)和國(guó)家科技支撐計(jì)劃(十一五)課題(2006BAI02A14)Supported by the National Nature Sciences Foundation of China(30471970) and the National Key Technology R&D Program in the 11th Five Year Plan of China (2006BAI02A14)

2011-04-06)