SNIF-NMR和IRMS技術(shù)在原產(chǎn)地葡萄酒鑒定中的應(yīng)用*

薛潔，蔣露

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

2(昆明市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，云南昆明，650018)

SNIF-NMR和IRMS技術(shù)在原產(chǎn)地葡萄酒鑒定中的應(yīng)用*

薛潔1，蔣露2

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

2(昆明市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，云南昆明，650018)

利用點(diǎn)特異性天然同位素分餾核磁共振技術(shù)(SNIF-NMR)和同位素比質(zhì)譜儀(IRMS)技術(shù)測定葡萄酒中穩(wěn)定性同位素D/H、18O/16O和13C/12C的比值，結(jié)果表明(D/H)Ⅱ、R、δ18O‰對(duì)產(chǎn)地的鑒別提供著主要信息，而(D/H)Ⅰ與δ13C‰提供了較次要的信息，單獨(dú)使用SNIF-NMR結(jié)果只能區(qū)別開環(huán)境差異很大的地區(qū)，加上δ13C‰后，可將溫差大的地區(qū)區(qū)別開，但對(duì)環(huán)境相似的地區(qū)仍無法有效鑒別，最后將(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰、δ18O‰同時(shí)考慮，對(duì)于環(huán)境相似的地區(qū)也可以有效鑒別。研究結(jié)果為中國葡萄酒原產(chǎn)地鑒別提供了一種新的技術(shù)手段。

SNIF-NMR，IRMS，葡萄酒，穩(wěn)定同位素分析，原產(chǎn)地

葡萄酒的香氣和口感與葡萄種植地有很大關(guān)系，原產(chǎn)地在葡萄酒質(zhì)量評(píng)價(jià)中起著非常重要的作用。1930年法國首先建立了原產(chǎn)地分級(jí)制度，即‘Appellation d’Origine Controlee’(AOC)，不久這種分級(jí)方法成為世界葡萄酒生產(chǎn)國的分級(jí)模式，如意大利的DOC制度、西班牙的DO制度、德國的QmP制度等，所有這些分級(jí)方法都是用于定義和保護(hù)特殊地理區(qū)域的葡萄酒，因此不同地理來源的葡萄酒進(jìn)行分類和鑒定成為葡萄酒行業(yè)的最近幾年研究熱點(diǎn)之一。

穩(wěn)定同位素分析技術(shù)是一種十分有效的分析工具，尤其在食品和飲料保真鑒定領(lǐng)域尤為重要［1］。1994年，意大利學(xué)者Ambrogio Monetti等利用SNIFNMR研究意大利不同地區(qū)、不同年份的葡萄酒，發(fā)現(xiàn)部分地區(qū)的數(shù)值出現(xiàn)重疊，單一使用該方法無法有效鑒別意大利的葡萄酒原產(chǎn)地，需要其他同位素參數(shù)的參與［2］，隨后許多研究將SNIF-NMR和IRMS技術(shù)結(jié)合起來用于葡萄酒的原產(chǎn)地鑒定中。2001年，Orginc等利用SNIF-NMR和IRMS技術(shù)分析葡萄酒中的δ13C‰ ，δ18O‰ 和2H/1H，對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的葡萄酒進(jìn)行了有效鑒別［3］;2001年西班牙學(xué)者 Josep等利用2H-SNIF-NMR和13C-IRMS技術(shù)對(duì)巴倫西亞地區(qū)紅葡萄酒原產(chǎn)地進(jìn)行了鑒別，分離效果也非常明顯［4］。但是由于同位素受氣候、土壤和水質(zhì)等多種因素的影響，它能否適應(yīng)于我國主要產(chǎn)區(qū)葡萄酒的鑒定還必須進(jìn)行深入的研究探討。本研究分析了我國4個(gè)主要葡萄產(chǎn)區(qū)葡萄酒中碳、氫、氧同位素的組成，探討了同位素分析技術(shù)在葡萄酒產(chǎn)地溯源的可行性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1．1．1 葡萄酒樣品

霞多麗葡萄品種，來自于2008年中國河北懷來、河北沙城、山東蓬萊和寧夏4個(gè)產(chǎn)區(qū)，實(shí)驗(yàn)室自制葡萄酒樣品，2007年4個(gè)產(chǎn)區(qū)的氣候條件如表1所示。

表1 07年懷來、沙城、煙臺(tái)、寧夏的氣象情況

1．1．2 儀器與設(shè)備

Bruker 400型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司;MAT-253型同位素比質(zhì)譜儀(測量精度優(yōu)于萬分之2)，美國Thermo Fosjer Scienlific公司;酒精分餾裝置，實(shí)驗(yàn)室自制。

1．1．3 主要化學(xué)試劑

四甲基脲(TMU):比利時(shí)歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測量研究院。平均標(biāo)準(zhǔn)海洋水(V-SMOW):國際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1．2．1 樣品制備

釀造工藝:參考文獻(xiàn)［5］，所有處理均重復(fù)3次。

1．2．2 葡萄酒中酒精和水的提取

1．2．2．1 酒精的提取

參照EU官方方法，將葡萄酒樣品裝入250 mL圓底燒瓶中，圓底燒瓶置于不斷回流的蒸餾儀器上，在78．0～78．2℃收集沸騰的液體，如果蒸餾過程中溫度超過78．5℃，中斷收集5 min，當(dāng)溫度降到78℃時(shí)再重新收集蒸餾液體直到溫度再次升到78．5℃，重復(fù)這些操作直到溫度保持恒定。收集的酒精樣品純度在92% ～93%(m/v)，回收率在95%以上。

1．2．2．2 水分的提取

將蒸餾后的葡萄酒殘?jiān)?，?00℃下繼續(xù)蒸餾，收集葡萄酒中的水分，對(duì)水分中的同位素進(jìn)行檢測。

2 樣品分析

2.1SNIF-NMR檢測

2．1．1 原理

由于植物代謝類型的不同，在葡萄汁發(fā)酵前添加外源糖，生成的乙醇會(huì)發(fā)生氘的同位素分餾現(xiàn)象，氘同位素會(huì)在以下 4個(gè)位置重新分布［4］:甲基位(CH2DCH2OH)、次 甲 基 (CH3CHDOH)、羥 基 位(CH3CH2OD)和水分子(HOD)，這種分布特點(diǎn)被稱為點(diǎn)特異性同位素分布，SNIF-NMR技術(shù)可以檢測出乙醇分子特定位置上氘的相對(duì)濃度［7］，如圖1所示。

圖1 葡萄酒乙醇分子2H-NMR分析圖譜

圖1中不同峰代表乙醇分子中不同位點(diǎn)D/H的比值，分析時(shí)通過添加一個(gè)已知D/H含量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，從而計(jì)算出葡萄酒乙醇分子各位點(diǎn)的D/H含量［8］。

2．1．2 NMR 檢測樣品的準(zhǔn)備［2］

準(zhǔn)確稱取 1．2．2．1 中制得的乙醇溶液 3．2 mg(精確至 0．1 mg)，加入 1．3 mgTMU(精確至 0．1 mg)，混勻，取450 μL 供 NMR 分析。

2．1．3 NMR檢測條件及計(jì)算公式

磁場強(qiáng)度:400 MHZ;共振頻率:61．2 MHZ;掃描寬度:1 200 Hz;檢測時(shí)間:6．8s;累計(jì)采樣次數(shù)2 043次［7］。

D/H 比值按下面的公式進(jìn)行計(jì)算［2，6，9］:

其中t為樣品的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2 IRMS檢測

2．2．1 IRMS檢測葡萄酒水分子18O/16O的原理

由于蒸騰作用，植株中同位素富集，使植物自身水分子中18O/16O的含量相對(duì)自來水、地表水較高［8］，如果在釀造期間外加水，其18O/16O的比值會(huì)降低，因此通過測定葡萄酒中水分子18O/16O的比值，可鑒別葡萄酒在生產(chǎn)過程中是否進(jìn)行了加水行為，目前測定18O/16O的比值主要利用IRMS技術(shù)。同位素比質(zhì)譜儀通過測CO2中離子質(zhì)量m/z 46(12C16O18O)和m/z 44(12C16O16O)比值的變化來判斷水中18O/16O同位素的含量［9］，主要反應(yīng)如下:

C16O16O(氣)+H218O(液)=C16O18O(氣)+H2160(液)

結(jié)果計(jì)算:

樣品中18O/16O的相對(duì)含量可用δ‰來表示［9］:

其中SMOW為國際標(biāo)準(zhǔn)參考值。

2．2．2 IRMS檢測葡萄酒乙醇分子13C/12C的原理

乙醇溶液在850℃高溫煅燒下，被氧化成CO2和H2O，然后在真空系統(tǒng)中除掉一切雜質(zhì)提取出純凈的CO2，供質(zhì)譜測量其碳同位素比值。

結(jié)果計(jì)算:

樣品中13C/12C的相對(duì)含量可用δ‰來表示:

其中PDB為國際標(biāo)準(zhǔn)參考值。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)區(qū)霞多麗葡萄酒中同位素分析結(jié)果

按照葡萄酒釀造工藝，利用不同地區(qū)的葡萄汁，生產(chǎn)出全汁干白葡萄酒，提取葡萄酒中的乙醇和水分別進(jìn)行SNIF-NMR和IRMS檢測，分別結(jié)果如表2所示。

LSD在0．05水平下分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)城市的(D/H)Ⅰ值差異均不明顯，(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰值寧夏、煙臺(tái)與河北省的兩個(gè)產(chǎn)區(qū)差異明顯，而4個(gè)產(chǎn)區(qū)的δ18O‰差異均顯著。

表2 各產(chǎn)區(qū)葡萄酒的C、H、O同位素分析結(jié)果

對(duì)各組數(shù)值進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，(D/H)Ⅱ、R、δ18O‰對(duì)產(chǎn)地的鑒別提供著主要信息，而δ13C‰與(D/H)Ⅰ提供了較次要的信息。詳細(xì)結(jié)果見總方差分解表(表3)和初始因子載荷表(表4)。這進(jìn)一步說明了(D/H)Ⅰ與δ13C‰與植物的種類有關(guān)，(D/H)Ⅱ與發(fā)酵環(huán)境有關(guān)，不同地區(qū)的葡萄酒(D/H)Ⅰ變化較小，在 97．386 9 ～98．573 9 mg/L，δ13C‰變化稍大，因其除了與植物光合作用途經(jīng)相關(guān)外，還與溫度有一定關(guān)系，在 -26．579‰ ～ -28．352‰之間變動(dòng)，而(D/H)Ⅱ與發(fā)酵環(huán)境有關(guān)，δ18O‰與降水量有關(guān)，所以不同地區(qū)的葡萄酒(D/H)Ⅱ、和δ18O‰值差異較大。

表3 總方差分解表

提取方法:主成分分析。

表4 旋轉(zhuǎn)前因子載荷表

提取方法:主成分分析。a．提取成分

利用主成分分析分別對(duì)單獨(dú)使用(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R 即 SNIF-NMR方法的結(jié)果，以及(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R 和 δ13C‰聯(lián)用，(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰和δ18O‰3個(gè)同位素同時(shí)測定，這3種情況進(jìn)行研究，得出如下結(jié)果:

從圖1可以看出，單獨(dú)利用SNIF-NMR檢測結(jié)果對(duì)4個(gè)產(chǎn)地的鑒別效果不明顯，尤其是對(duì)煙臺(tái)、懷來和沙城3個(gè)產(chǎn)區(qū)的鑒別力度很弱，這主要是因?yàn)榈貐^(qū)間(D/H)Ⅰ值變化很小，所以就(D/H)Ⅱ和R作為第1主成分只能鑒別出環(huán)境差異很大的地區(qū)，如內(nèi)陸氣候的寧夏產(chǎn)區(qū)。當(dāng)加入δ13C‰指標(biāo)后(圖2)，煙臺(tái)也得到了很好的區(qū)分，環(huán)境非常相似的沙城和懷來還是部分重疊，δ13C‰主要受植株的光合作用途徑和溫度的影響，所以在(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R的基礎(chǔ)上加上δ13C‰，就將日照強(qiáng)度明顯不同、離海洋更近的煙臺(tái)與懷來和沙城區(qū)別開來。同時(shí)利用(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰和δ18O‰對(duì)進(jìn)行原產(chǎn)地的鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)區(qū)分度又進(jìn)一步提高，基本只有懷來和沙城的1～2個(gè)樣品未被分開，δ18O‰值與降雨量有關(guān)，說明δ18O‰對(duì)地理環(huán)境相似、天氣情況也雷同，但降雨量不同的地區(qū)區(qū)分度較大。試驗(yàn)對(duì)不同地區(qū)的紅葡萄酒樣品也進(jìn)行了鑒別分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與白葡萄酒基本一致，其(D/H)Ⅰ在 97．0257 ～ 98．378 3 mg/L δ13C‰值在 -25．626% ～ -28．228‰。因此，由實(shí)驗(yàn)可知，聯(lián)合SNIF-NMR和IRMS技術(shù)檢測葡萄酒里的C、H、O同位素，能有效鑒別環(huán)境差異大的地區(qū)的葡萄酒產(chǎn)品，對(duì)環(huán)境相似的地區(qū)在一定程度上也能將其區(qū)別開來，是一種比較可行的鑒別葡萄酒原產(chǎn)地的方法。

3.2 同一地區(qū)不同品種葡萄酒中同位素分析結(jié)果

世界上適合釀造葡萄酒的葡萄品種有幾千種。在同樣的栽培條件下，不同的品種，具有不同的色香味，含有不同量的糖、酸、芳香物質(zhì)、酚類物質(zhì)及其他物質(zhì)。這些成分，決定了所釀成的葡萄酒的酒度、酸度、芳香性、優(yōu)雅性。有的香氣特別濃，有的顏色特別深。因此，許多葡萄酒生產(chǎn)廠商將不同的葡萄品種巧妙地搭配使用，釀造混合型的葡萄酒，從而取長補(bǔ)短，相得益彰。那么，不同品種葡萄釀造出的葡萄酒其C、H、O穩(wěn)定同位素的含量差異是否明顯，也是此次的研究內(nèi)容，本實(shí)驗(yàn)對(duì)同一產(chǎn)區(qū)同一時(shí)間收獲的干紅葡萄酒釀造品種赤霞珠和梅鹿輒采用相同工藝釀造的葡萄酒進(jìn)行C、H、O同位素檢測，結(jié)果見表5。

圖1 SNIF-NMR鑒別原產(chǎn)地的結(jié)果

圖2 (D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R和 δ13C‰對(duì)原產(chǎn)地的鑒別結(jié)果

圖3 (D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰和 δ18O‰對(duì)原產(chǎn)地的鑒別結(jié)果

表5 葡萄品種對(duì)同位素的影響

結(jié)果研究表明:同一產(chǎn)區(qū)同一時(shí)間收獲的不同葡萄品種，采用相同工藝釀造出的葡萄酒其δ18O‰、δ13C‰、(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ、R 值均非常接近，不存在顯著性差異，說明品種對(duì)葡萄酒的同位素含量影響不大。進(jìn)一步說明(D/H)Ⅱ和δ18O‰與葡萄植株的產(chǎn)區(qū)降水量等環(huán)境條件相關(guān)，赤霞珠和梅鹿輒在同一產(chǎn)區(qū)栽培、同一時(shí)間收獲，其土壤條件、氣候條件都一致，所以(D/H)Ⅱ和 δ18O‰變化很小;而(D/H)Ⅰ和δ13C‰的含量主要取決于發(fā)酵原料的生物起源，即植株的種類。赤霞珠和梅鹿輒葡萄均屬C3植物，光合作用途徑相同，同屬葡萄品種，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明其(D/H)Ⅰ和δ13C‰值在同一范圍內(nèi)。

4 結(jié)論

本研究利用SNIF-NMR和IRMS技術(shù)對(duì)國內(nèi)河北懷來、河北沙城、寧夏、煙臺(tái)4個(gè)產(chǎn)區(qū)的葡萄酒進(jìn)行C、H、O 同位素測定，研究發(fā)現(xiàn)(D/H)Ⅱ、R、δ18O‰對(duì)產(chǎn)地的鑒別提供著主要信息，而(D/H)Ⅰ與δ13C‰提供了較次要的信息，單獨(dú)使用SNIF-NMR技術(shù)的結(jié)果只能區(qū)別開環(huán)境差異很大的地區(qū)，加上δ13C‰后，進(jìn)一步將溫差大的地區(qū)區(qū)別開，但對(duì)環(huán)境相似的地區(qū)仍無法有效鑒別，最后將(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰、δ18O‰同時(shí)利用，可將環(huán)境相似的2個(gè)地區(qū)有效區(qū)分開。

通過分析同一產(chǎn)區(qū)的不同品種葡萄酒發(fā)現(xiàn)，葡萄品種對(duì)同位素含量的影響不明顯，因此推斷利用(D/H)Ⅱ、R、δ13C‰、δ18O‰同位素判別葡萄酒產(chǎn)區(qū)不受葡萄品種的影響。

天然同位素分析技術(shù)是一種國際通用的酒類產(chǎn)品分析方法，在葡萄酒及蒸餾酒中普遍應(yīng)用，歐盟各國家通過分析葡萄酒的同位素信息，在意大利Ispra的歐盟聯(lián)合研究中心(JRC)中建立了“葡萄酒數(shù)據(jù)銀行”，記錄了不同年份、不同地區(qū)、不同品種的葡萄酒同位素信息，通過分析酒樣中各同位素的含量，然后與數(shù)據(jù)銀行中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從而為葡萄酒產(chǎn)地、年份、品種的判別提供依據(jù)。利用穩(wěn)定同位素分析，從原子水平對(duì)產(chǎn)區(qū)酒進(jìn)行分析在國內(nèi)還沒見相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)的應(yīng)用為我國葡萄酒質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了全新的技術(shù)支持。

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The Preliminary Research on Wine Geographical Origins Determination by SNIF-NMR and IRMS Methods

Xue Jie1，Jiang Lu2
1(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027，China)
2(Agricultural Product Quality Safety Center in Kunming，Kunming 650018，China)

SNIF-NMR and IRMS methods were used to determine the stable isotopic ratios of D/H and18O/16O of wine．The results showed that methylene(D/H)Ⅱof ethanol in wine，R andδ18O‰ are the key determinants in identifying the geographical origin of wines whereas methyl(D/H)Ⅰsite andδ13C‰ provide less significant information．Using the results of SNIF-NMR alone can only distinguish areas of considerably different environment．If coupled withδ13C‰，the areas with different temperature can be distinguished，but the areas with similar environment still cannot be separated．If combined the values of(D/H)Ⅰ，(D/H)Ⅱ，R，δ13C‰ andδ18O‰，SNIF-NMR and IRMS methods can differentiate areas with similar environment．The research outcome provides a new technique to determine the geographical origins of Chinese wine．

SNIF-NMR，IRMS，wine，stable isotopes analysis，geographical origin of wines

博士，高級(jí)工程師。

*中國輕工集團(tuán)科技基金項(xiàng)目

2010-11-08，改回日期:2010-11-25