發(fā)芽燕麥不同溶劑提取液抗氧化活性的比較*

付曉燕，李海龍，楊超，謝筆鈞，孫智達

1(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢，430070)2(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢，430205)

發(fā)芽燕麥不同溶劑提取液抗氧化活性的比較*

付曉燕1，2，李海龍1，楊超1，謝筆鈞1，孫智達1

1(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢，430070)2(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢，430205)

將燕麥種子進行發(fā)芽，對未發(fā)芽原樣、發(fā)芽6 d的籽粒、芽和根分別用體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇、乙醇和丙酮溶液提取其多酚，測定了不同溶劑提取液的總酚提取率、清除DPPH·自由基的能力、還原能力以及清除亞硝酸鹽的能力，并對其差異性及相關(guān)性進行了分析。結(jié)果表明:發(fā)芽前后燕麥多酚均具有較強的清除DPPH·自由基的能力及較強的還原能力，對亞硝酸鹽也具有一定的清除作用。不同溶劑提取液的抗氧化活性與其總酚種類和極性密切相關(guān)，發(fā)芽在一定程度上提高了燕麥的抗氧化活性。

燕麥，發(fā)芽，多酚，抗氧化活性

燕麥屬禾本科植物，是世界主要農(nóng)作物之一，在世界八大糧食作物中，總產(chǎn)量居第五位。我國燕麥的種植面積不大，主要產(chǎn)區(qū)分布在內(nèi)蒙古、山西、河北等地。燕麥被認(rèn)為是谷物食品中最好的全價營養(yǎng)食品，具有營養(yǎng)與保健雙重功效［1－2］。

抗氧化活性是燕麥諸多生理功能中較為突出的一個，燕麥中含有多種抗氧化成分，如植酸、甾醇、VE等，最主要的抗氧化成分是酚類物質(zhì)［3］。研究表明，燕麥中的酚類物質(zhì)主要包括各種酚酸、燕麥蒽酰胺和黃酮類化合物等，其中燕麥蒽酰胺是燕麥中所特有的酚類物質(zhì)，它由一系列羥基肉桂酸及其衍生物和鄰氨基苯甲酸及其衍生物通過酰胺鍵(—HNCO—)相連而成［4］。

種子萌發(fā)涉及到一系列形態(tài)上和生理生化的變化，營養(yǎng)成分含量的增加和生物利用率的提高，抗?fàn)I養(yǎng)因子的不利因素被減弱或消除這些現(xiàn)象在開發(fā)芽類食品方面受到了人們的關(guān)注［5］。目前對于燕麥發(fā)芽的研究主要集中在發(fā)芽過程中三大營養(yǎng)素及其相關(guān)酶活性的變化方面，對發(fā)芽燕麥酚類物質(zhì)的研究相對較少。本實驗對發(fā)芽燕麥不同溶劑提取液的總酚提取率及抗氧化活性進行了比較，旨在為燕麥的深度開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

晉燕八號裸燕麥，由山西省農(nóng)科院高寒作物研究所提供。

Folin-Ciocalteau試劑和DPPH·自由基(Sigma公司);甲醇、乙醇、丙酮、沒食子酸、碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、鹽酸、亞硝酸鈉、對氨基苯甲酸、鹽酸萘乙二胺等試劑均為分析純，購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

250B生化培養(yǎng)箱，江蘇金壇市宏華儀器廠;多功能食品粉碎機，飛利浦家庭電器有限公司;AC 210S電子天平，美國Sartorius Instrument Ltd;SHZ－82A恒溫水浴振蕩器，國華儀器廠;755B分光光度計，上海精制科學(xué)儀器廠;TDL－5離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;FD-1-50冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 燕麥種子發(fā)芽

將燕麥種子用2%次氯酸鈉溶液于室溫下浸泡15 min，洗去殘余的次氯酸鈉溶液，用蒸餾水浸漬種子于18℃生化培養(yǎng)箱中浸泡16～18 h，將種子瀝干后置于自制發(fā)芽盤中于18℃培養(yǎng)箱中連續(xù)發(fā)芽6 d，培養(yǎng)箱保持濕度在95%以上。將發(fā)芽6 d的燕麥分為籽粒、芽和根3部分，于冷凍干燥機中干燥36 h以待后續(xù)實驗用。

1.3.2 燕麥多酚的提取

準(zhǔn)確稱取一定量的樣品粉末(包括未發(fā)芽原樣、6 d籽粒、6 d芽和6 d根)于帶塞三角瓶中，按料液比1∶40(g∶mL)分別加入體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇、乙醇和丙酮溶液，置于50℃水浴搖床中提取2 h，提取結(jié)束后抽濾，將提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收有機溶劑，濃縮樣品，樣品定容后以10 000 r/min離心10 min，制得不同溶劑的多酚提取液，用于測定總酚含量及抗氧化活性。

1.3.3 總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteau法［6］，準(zhǔn)確吸取待測液0.1 mL，依次加入6 mL蒸餾水，0.5 mL Folin-Ciocalteau試劑，混勻后加入20%的Na2CO3溶液1.5 mL，充分混勻，定容10 mL，在室溫下靜置1 h后于765 nm下測定其吸光度。總酚提取率(mg/g)以沒食子酸當(dāng)量表示。

1.3.4 清除DPPH·自由基能力的測定

采用 Amelie Fagerlund［7］等人報道的方法，取不同濃度的樣品溶液2.0 mL和2×10－4mol/L的DPPH·自由基乙醇溶液2.0 mL，加入同一具塞試管中，搖勻，在室溫避光反應(yīng)30 min后于517 nm處測其吸光度，計算燕麥多酚對DPPH·自由基的清除率，公式如下:

清除率/%= ［1－(Ai－Aj)/A0］×100

式中:A0為對照組吸光度;Ai為樣品組吸光度;Aj為空白組吸光度。

1.3.5 還原能力的測定

采用Qing Liu［8］等人報道的方法，取不同濃度的樣品溶液1.0 mL，加入0.2 mol/L，pH值6.6的磷酸鈉緩沖液1.0 mL及1%的鐵氰化鉀溶液1.0 mL，于50℃水浴反應(yīng)20 min后急速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液1.0 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.0 mL及0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，混合均勻，10 min后于700 nm處測定其吸光度，吸光值越大表示還原能力越強。

1.3.6 清除亞硝酸鹽能力的測定

采用郭艷華［9］等人報道的方法，取不同濃度的樣品溶液1.0 mL，加入pH值3.0的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液2.5 mL，再加入100 mg/kg的NaNO2溶液0.5 mL，用蒸餾水定容到5.0 mL，37℃恒溫1 h。然后取反應(yīng)液1.0 mL，加入0.4%的對氨基苯磺酸2.0 mL與0.2%的N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶液2.0 mL，搖勻放置15 min后，于540 nm處測其吸光度，根據(jù)以下公式計算NaNO2的清除率:

清除率/%= ［1－(Ai－Aj)/A0］×100

式中:A0為對照組吸光度;Ai為樣品組吸光度;Aj為空白組吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)芽前后不同溶劑對總酚提取率的影響

在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，燕麥種子發(fā)芽過程中總酚含量呈上升趨勢，且芽和根中總酚相對含量明顯高于籽粒，發(fā)芽6 d以后總酚含量的增幅逐漸減小，故選擇發(fā)芽6 d的樣品作為研究對象。

由圖1可以看出，原樣、6 d籽粒和根中3種溶劑總酚提取率為甲醇＞乙醇＞丙酮，而芽中則恰恰相反。一般認(rèn)為游離的多酚存在較多的未被結(jié)合的游離態(tài)酚羥基并且易溶解于甲醇、乙醇等極性溶劑中［10］，由于丙酮屬于中等極性溶劑，因此可以推測出燕麥種子發(fā)芽后不同部位的多酚極性存在差異，籽粒和根中的酚類物質(zhì)極性較大，而芽中有相當(dāng)數(shù)量中等極性的酚類物質(zhì)。

圖1 發(fā)芽前后不同溶劑提取液的總酚提取率

表1 不同溶劑總酚提取率差異性分析(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)1)

2.2 發(fā)芽前后不同溶劑提取液清除DPPH·自由基能力的比較

DPPH·是一種化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，不易被清除，若受試物能夠清除它，則表示受試物具有較強的自由基清除能力［11］。其主要原理是測定反應(yīng)混合物517 nm處吸光值的降低，因為DPPH·有個單電子，當(dāng)接受供試物的電子或氫自由基后，形成穩(wěn)定的抗磁分子，原517 nm處的吸光值明顯減小，色澤由紫變黃［12］，其顏色變得越淺表明供試物的抗氧化能力越強。樣品對DPPH·自由基的清除能力一般以IC50值表示，IC50值越小表明樣品的抗氧化能力越強。

由圖2可以看出，在測定的濃度范圍內(nèi)，樣品對DPPH·自由基的清除作用隨著其濃度增大而增強。由表2(以總酚濃度計，下同)可見，4個樣品中不同溶劑提取液對DPPH·自由基的清除能力均呈現(xiàn)顯著性差異，在6 d籽粒和芽中，丙酮、乙醇和甲醇提取液的清除能力呈遞減趨勢，而原樣中乙醇提取液的清除能力最弱，根中反而最強。這說明不同部位抗氧化物質(zhì)的種類和極性不同，導(dǎo)致不同溶劑提取液中抗氧化物質(zhì)的種類和量均有所差異，最終表現(xiàn)在清除DPPH·自由基能力的強弱上。

觀察發(fā)芽前后IC50值的變化，可以看出籽粒的乙醇提取液清除DPPH·自由基的能力較原樣有所提高，甲醇和丙酮提取液的清除能力均略有下降，根的3種溶劑提取液清除能力普遍較強，而芽相對較差，這在一定程度上說明芽中富含的中等極性酚類物質(zhì)抗氧化活性較差。

圖2 發(fā)芽前后不同溶劑提取液清除DPPH·自由基的能力

表2 不同溶劑提取液清除DPPH·自由基的IC50值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.3 發(fā)芽前后不同溶劑提取液還原能力的比較

研究表明，抗氧化劑的還原力與其抗氧化活性之間存在聯(lián)系，抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子而使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子，從而失去活性［11］。通常以吸光值達0.5時所需試樣的濃度(EC50)來衡量其還原能力的強弱，EC50值越小表明試樣還原能力越強，抗氧化性也越強。

由圖3可以看出，隨著試樣濃度的增加，其吸光值增大，但不同溶劑提取液的還原能力存在一定差異(表3)。值得注意的是，原樣和6 d籽粒中，3種溶劑提取液還原能力的大小與清除DPPH·自由基的能力呈一定的正相關(guān)性，即試樣清除DPPH·自由基的能力愈強，則其表現(xiàn)出愈強的還原能力，而芽和根中二者呈負(fù)相關(guān)。上述現(xiàn)象可能是由于燕麥發(fā)芽后不同部位中的抗氧化物質(zhì)供氫和供電子相對能力的強弱差異所致，這也與不同部位抗氧化物質(zhì)的種類和極性密切相關(guān)。

觀察發(fā)芽前后EC50值的變化，可以看出發(fā)芽后籽粒的3種溶劑提取液其還原能力均較相應(yīng)的原樣提取液有所下降，而芽和根的提取液還原能力普遍較強，根略強于芽。

圖3 發(fā)芽前后不同溶劑提取液的還原能力

表3 不同溶劑提取液還原力的EC50值(平均值標(biāo)準(zhǔn)差)

表3 不同溶劑提取液還原力的EC50值(平均值標(biāo)準(zhǔn)差)

EC50/( μg·mL－1)甲醇 乙醇 丙酮原樣 28.77±0.224a50.37±0.130b13.12±0.121c 6 d籽粒 53.99±0.090a51.23±0.031b32.66±0.062c 6 d芽 18.05±0.460a19.50±0.207b20.09±0.169b 6 d根 17.96±0.372a18.77±0.218b17.39±0.357a

2.4 發(fā)芽前后不同溶劑提取液清除亞硝酸鹽能力的比較

亞硝酸鹽與胺類化合物在酸性環(huán)境或細(xì)菌作用下容易形成N-亞硝基化合物(NC)，NC能引起人體和動物的肝臟等多種器官的惡性腫瘤，是最令人類關(guān)注的一類化學(xué)致癌物質(zhì)［13］。清除體內(nèi)亞硝酸鹽是阻斷NC合成的有效途徑，從而達到防癌的目的。

圖4 發(fā)芽前后不同溶劑提取液清除亞硝酸鹽的能力

由圖4可以看出，燕麥發(fā)芽前后不同溶劑提取液均具有一定的清除亞硝酸鹽的能力，且隨著樣品濃度的提高，清除效果逐漸增強，3種溶劑提取液清除效果的差異見表4。將表4與表2、表3綜合比較可以難發(fā)現(xiàn)，4個樣品中不同溶劑提取液清除亞硝酸鹽的能力與其清除DPPH·自由基的能力和還原能力均呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，這說明提取液清除亞硝酸鹽的能力與其中抗氧化物質(zhì)供氫和供電子的能力存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。由于燕麥中的抗氧化成分組成復(fù)雜，其防癌的有效成分可能也并不止一種。

觀察發(fā)芽前后IC50值的變化，可以看出發(fā)芽后籽粒、芽和根的3種溶劑提取液清除亞硝酸鹽的能力都較相應(yīng)的原樣提取液明顯提高，這說明發(fā)芽可以作為一種提高燕麥防癌功效的手段，為燕麥發(fā)芽食品的研究和開發(fā)提供了一定思路。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，燕麥發(fā)芽后籽粒、芽和根中酚類物質(zhì)的種類和極性不同，從而導(dǎo)致甲醇、乙醇和丙酮提取液的總酚提取率存在差異，進而表現(xiàn)在不同溶劑提取液抗氧化活性的強弱上。發(fā)芽前后燕麥多酚對DPPH·自由基均具有較強的清除效果，并具有較強的還原能力，對亞硝酸鹽也具有良好的清除作用。不同溶劑提取液在3個反應(yīng)體系中的作用有一定的相關(guān)性，原樣和6 d籽粒中，3種溶劑提取液的還原能力與清除DPPH·自由基的能力正相關(guān)，與清除亞硝酸鹽的能力負(fù)相關(guān);而芽和根中，3種溶劑提取液的還原能力與清除DPPH·自由基的能力負(fù)相關(guān)，與清除亞硝酸鹽的能力正相關(guān)。

燕麥發(fā)芽后，根提取液在3個體系中均表現(xiàn)出較強的活性，芽提取液除還原能力高于籽粒外，清除DPPH·自由基和亞硝酸鹽的能力均相對較弱，由此推測芽中富含的中等極性酚類物質(zhì)可能并不是關(guān)鍵的活性物質(zhì)。值得關(guān)注的是，發(fā)芽在一定程度上提高了燕麥的抗氧化活性，并大大提高了燕麥的防癌功效，為燕麥功能食品的開發(fā)提供了一定依據(jù)。

此外，燕麥抗氧化活性的強弱可能也與酚類物質(zhì)以外的某些抗氧化成分有較大關(guān)系，因此有必要對提取液進一步純化，從而深入了解燕麥抗氧化活性與其中各種抗氧化物質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系。

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Comparison of Antioxidant Activity for Different Solvents Extracts from Germinationed Oat

Fu Xiao-yan1，2，Li Hai-long1，Yang Chao1，Xie Bi-jun1，Sun Zhi-da1

1(College of Food Science and Technology Huazhong Agricultural University，Wuhan，430070，China)2(College of Food ＆ Biology Science and Technology，Chutian College，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430205，China)

Oat seeds were steeped and germinated.Polyphenol compounds were extracted by 80%methanol，ethanol and acetone solvent respectively from non-germination oat，germinated seed，bud and root after 6 d＇s germination.Total phenolic yield，reducing power，scavenging activity to DPPHo radical and nitrite have compared.The results indicated that oat polyphenols had strong reducing power and scavenging effects to DPPHo radical and nitrite in both germinated and non－germinated seeds.The antioxidant activity of different solvents extracts was closely related to the kind and polarity of oat polyphenols.The antioxidant activity was higher in the germinated seeds.

oat，germination，polyphonols，antioxidant activity

碩士研究生(孫智達教授為通訊作者)。*"十一五"國家科技支撐計劃項目(2006BAD27B09)

2010－11－21，改回日期:2011－02－15