雙有機(jī)溶劑中黑曲霉脂肪酶催化阿魏酸的酯化反應(yīng)*

劉煥珍，王明茲，郭英佳，鄭麗妃，Guo Zheng，Xu Xuebing，陳必鏈

1(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建福州，350108)2(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州，350108)3(Faculty of Science，University of Aarhus，Aarhus，Denmark)

雙有機(jī)溶劑中黑曲霉脂肪酶催化阿魏酸的酯化反應(yīng)*

劉煥珍1，2，王明茲1，2，郭英佳2，鄭麗妃2，Guo Zheng3，Xu Xuebing3，陳必鏈1，2

1(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建福州，350108)2(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州，350108)3(Faculty of Science，University of Aarhus，Aarhus，Denmark)

在雙有機(jī)溶劑體系中，用黑曲霉脂肪酶催化合成阿魏酸油醇酯，考察酶濃度、溫度和底物摩爾比等因素對(duì)酯化反應(yīng)的影響。結(jié)果表明:在異辛烷/丁酮體系中，當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃，阿魏酸和油醇的摩爾比為1∶8，即阿魏酸濃度為0.39 mg/mL和油醇濃度為4.3 mg/mL，脂肪酶濃度為0.2 g/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率為97.6%;而在環(huán)己烷/丁酮體系中，當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃，阿魏酸和油醇的摩爾比為1∶8，即阿魏酸濃度為0.49 mg/mL和油醇濃度為5.37 mg/mL，脂肪酶濃度為 0.25 g/mL 時(shí)，轉(zhuǎn)化率為 91.0%。

脂肪酶，酯化，有機(jī)溶劑，阿魏酸，油醇

阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)，其化學(xué)名稱(chēng)為4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸，屬于酚酸的一種，具有順式和反式兩種異構(gòu)體。谷物、水果、蔬菜和咖啡中富含游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的阿魏酸［1］。阿魏酸低毒性，易被人體吸收和代謝，具有多種生理功能，包括抗氧化、抗菌、抗炎癥、抗血栓和抗癌等，對(duì)冠狀動(dòng)脈疾病具有治療效果，能降低膽固醇和增加精子活力，被廣泛用于食品和化妝品中［2］。

由于阿魏酸的親水特性限制了它在脂肪和油類(lèi)體系中的應(yīng)用，通過(guò)酯化作用，也就是將醇與阿魏酸的羧基進(jìn)行酯化產(chǎn)生阿魏酸酯可以克服這個(gè)缺陷。酶催化阿魏酸進(jìn)行酯交換反應(yīng)已有研究報(bào)道，如用不同來(lái)源的脂肪酶:Novozyme 435、Candida rugosa、Chromobacterium viscosum 和 Pseudomonas sp.等催化乙烯阿魏酸與羥基類(lèi)固醇和p-熊果苷進(jìn)行酯交換反應(yīng)［3］;用Novozyme 435催化亞麻籽油與肉桂酸或阿魏酸發(fā)生酯交換反應(yīng)［4］;以離子液體為反應(yīng)介質(zhì)，采用化學(xué)催化劑和脂肪酶作為催化劑以阿魏酸為底物合成阿魏酸單甘油酯和阿魏酸雙甘油酯［5］。本文作者研究了在異辛烷/丁酮雙溶劑體系中，Novozym 435脂肪酶催化合成阿魏酸油醇酯［6］，本文繼續(xù)該研究工作，研究黑曲霉脂肪酶在異辛烷/丁酮或環(huán)己烷/丁酮溶劑體系中催化阿魏酸與油醇的酯化反應(yīng)，并優(yōu)化了反應(yīng)條件。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

黑曲霉脂肪酶，深圳綠微康生物工程有限公司，酶活力為8000單位每克酶粉(水解活力);分析純反式阿魏酸和4 ?分子，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;分析純油醇，Sigma公司;色譜純甲醇，上海國(guó)藥集團(tuán);封口膜，英國(guó)Alcan Group公司。其他試劑均為市售分析純。

美國(guó)安捷倫1100高效液相色譜儀，瑞士Mettler Toledo電子分析天平，湘儀臺(tái)式離心機(jī)，上海智誠(chéng)恒溫培養(yǎng)搖床。

1.2 方法

1.2.1 酶催化酯化反應(yīng)

將一定量阿魏酸溶于丁酮，一定量油醇溶于待測(cè)溶劑，分別取前者1 mL，后者9 mL于50 mL具塞三角燒瓶中，加入一定量脂肪酶，并用封口膜將瓶口封好，置于恒溫?fù)u床上，轉(zhuǎn)速為150 r/min，12 h后加一定量4 ?分子篩，每48 h取1次樣，每次取100 μL。進(jìn)行阿魏酸和油醇摩爾比實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定阿魏酸的量，將3.9 mg或4.9 mg阿魏酸溶于1 mL的丁酮中，按一定比例增加油醇的量，即 5.4、21.5、43、64.4 mg 或6.7、26.8、53.7、80.5 mg 油醇溶于 9 mL 的異辛烷或環(huán)己烷中，使酸醇摩爾比分別為 1∶1、1∶4、1∶8、1∶12。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值。

1.2.2 阿魏酸轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

將100 μL樣品溶于900 μL甲醇中，儲(chǔ)于 -20℃冰箱待分析。采用高效液相色譜方法分析阿魏酸油醇酯的含量，色譜柱為Hypersil ODS-C18 reversed-phase column(5 μm，250 ×4.0 mm，Agilent)，上樣量為20 μL，流速為1 mL/min，洗脫液:A液為95%甲醇，B液為5%水，柱溫為35℃，檢測(cè)器為紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器。用各組分的HPLC峰面積比表征產(chǎn)物與底物相對(duì)含量比(n/n)。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)溶劑混合物的影響

阿魏酸在丁酮的溶解度較大，但丁酮是親水性的有機(jī)溶劑，能夠剝奪酶表面的必需水，使酶的構(gòu)象發(fā)生改變［7］，從而降低了脂肪酶的活性。因此，將疏水性的有機(jī)溶劑和丁酮組成雙溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，一方面可以減少酶活的損失，另一方面又可以適當(dāng)?shù)卦黾影⑽核岬娜芙舛?。本文采用正辛烷、異辛烷、正庚烷、環(huán)己烷和丁酮構(gòu)成雙溶劑體系，丁酮的用量為10%。不同的雙有機(jī)溶劑體系對(duì)阿魏酸和油醇酯化反應(yīng)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同的雙有機(jī)溶劑對(duì)阿魏酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1可知，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，阿魏酸轉(zhuǎn)化率逐漸提高。到第10天時(shí)，在正辛烷/丁酮、異辛烷/丁酮、正庚烷/丁酮、環(huán)己烷/丁酮溶劑體系中，轉(zhuǎn)化率分別為 84.0%、85.4%、84.3%、79.1%。脂肪酶的催化活性與溶劑的疏水性參數(shù)log P值間有一定的相關(guān)性，正辛烷、異辛烷、正庚烷、環(huán)己烷的log P值分別為 4.5、4.5、4.0、3.2。Lee 等人［8］研究溶劑對(duì)酶促合成對(duì)甲氧基肉桂酸辛醇酯的影響，在丙酮、叔丁醇、甲苯、正己烷、庚烷、異辛烷等幾種溶劑中，發(fā)現(xiàn)在log P值最高的異辛烷中，對(duì)甲氧基肉桂酸的轉(zhuǎn)化率最高。而熊健等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)隨著溶劑log P值的降低，轉(zhuǎn)化率逐漸升高［9］。本實(shí)驗(yàn)還觀察到在異辛烷/丁酮體系中阿魏酸的轉(zhuǎn)化率較高，而在環(huán)己烷/丁酮體系中阿魏酸的溶解度較大，因此選擇異辛烷或環(huán)己烷與丁酮構(gòu)成雙溶劑體系進(jìn)行后續(xù)的研究。

2.2 酶濃度的影響

在異辛烷/丁酮體系、環(huán)己烷/丁酮體系中，酶濃度對(duì)阿魏酸酯化反應(yīng)的影響分別見(jiàn)圖2A和2B。

圖2 在異辛烷/丁酮體系(A)和環(huán)己烷/丁酮體系(B)中酶濃度對(duì)阿魏酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2A可知，在異辛烷/丁酮體系中，當(dāng)酶濃度從0.05 g/mL升至0.2 g/mL時(shí)，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率從72.1%增至 87.1%，當(dāng)脂肪酶的濃度為 0.2 g/mL時(shí)，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率最大為87.1%，因此最適酶濃度為0.2 g/mL。由圖2B可知，在環(huán)己烷/丁酮體系中，當(dāng)酶濃度從0.05 g/mL升至0.25 g/mL，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率從62.6%增至82.5%;再增加酶濃度至0.3 g/mL時(shí)，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率反而下降。因此脂肪酶的最適濃度為0.25 g/mL。

2.3 反應(yīng)溫度的影響

在異辛烷/丁酮體系、環(huán)己烷/丁酮體系中，反應(yīng)溫度對(duì)阿魏酸酯化反應(yīng)的影響分別見(jiàn)圖3A和3B。

由圖3A可知，在異辛烷/丁酮體系中，當(dāng)溫度從55℃升到60℃，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率從84.0%增至88.5%;當(dāng)溫度升高到65℃時(shí)，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率為86.1%。因此最適溫度為60℃。由圖3B可知，在環(huán)己烷/丁酮體系中，當(dāng)溫度從50℃升到60℃，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率從64.6%增至86.5%?？紤]到當(dāng)溫度低于50℃時(shí)阿魏酸的溶解度較低，而異辛烷的沸點(diǎn)為99.2℃、正己烷的沸點(diǎn)為80.7℃，當(dāng)溫度高于60℃時(shí)對(duì)酶的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑的發(fā)揮性都有較大的影響，因此在環(huán)己烷/丁酮體系中未選擇更高的溫度如65℃進(jìn)行試驗(yàn)。Novozym 435催化酯合成反應(yīng)的反應(yīng)溫度范圍也都選擇在50 ～60 °C［10］。

2.4 阿魏酸和油醇摩爾比的影響

在異辛烷/丁酮體系、環(huán)己烷/丁酮體系中，底物酸醇摩爾比對(duì)脂肪酶催化阿魏酸酯化反應(yīng)的影響分別見(jiàn)圖4A和4B。

圖3 在異辛烷/丁酮體系(A)和環(huán)己烷/丁酮體系(B)中反應(yīng)溫度對(duì)阿魏酸轉(zhuǎn)化率的影響

圖4 在異辛烷/丁酮體系(A)和環(huán)己烷/丁酮體系(B)中酸醇摩爾比對(duì)阿魏酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖4A可知，在異辛烷/丁酮體系中，反應(yīng)12 d，阿魏酸和油醇的摩爾比為 1∶1時(shí)，轉(zhuǎn)化率為24.6%;當(dāng)阿魏酸和油醇的摩爾比為1∶8時(shí)，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率最大為86.1%;當(dāng)酸醇摩爾比再增至1∶12時(shí)，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率略有下降為85.2%。因此酸醇最適摩爾比為1∶8。由圖4B可知，在環(huán)己烷/丁酮體系中，反應(yīng)12天，當(dāng)阿魏酸和油醇的摩爾比為1∶1時(shí)，轉(zhuǎn)化率為28.4%;酸醇摩爾比為1∶8時(shí)，阿魏酸的最大轉(zhuǎn)化率為67.2%;酸醇摩爾比再增至1∶12時(shí)，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率降為64.12%。因此本實(shí)驗(yàn)以1∶8的酸醇摩爾比為最適底物摩爾比。

Lue［11］等人研究脂肪酶催化肉桂酸和油醇的酯化反應(yīng)，以及本課題組研究在異辛烷/丁酮體系中Novozym 435脂肪酶催化阿魏酸和油醇的酯化反應(yīng)［6］，都未發(fā)現(xiàn)醇抑制酯化反應(yīng)的現(xiàn)象。在脂肪酶催化異丁酸和正丁醇的酯化反應(yīng)［12］以及丁酸和2-四氫呋喃甲醇的酯化反應(yīng)時(shí)［13］，過(guò)量的醇對(duì)酶都表現(xiàn)出抑制現(xiàn)象。在脂肪酶催化棕櫚酸和異丙醇的酯化反應(yīng)過(guò)程中，兩種底物都表現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象［14］。

2.5 優(yōu)化后的反應(yīng)

在異辛烷/丁酮體系、環(huán)己烷/丁酮體系中優(yōu)化后的反應(yīng)見(jiàn)圖5。

圖5 優(yōu)化后的阿魏酸酯化反應(yīng)

在異辛烷/丁酮體系中，得出優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:異辛烷9 mL，丁酮1 mL，反應(yīng)溫度為60℃，阿魏酸和油醇的摩爾比為1∶8，阿魏酸0.39 mg/mL，油醇4.3 mg/mL，分子篩 5 mg/mL，黑曲霉脂肪酶 0.2 g/mL，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。反應(yīng)8 d就基本達(dá)到平衡，阿魏酸的轉(zhuǎn)化率為95.5%，反應(yīng)12 d時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值為97.6%。在環(huán)己烷/丁酮體系中，得出優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:環(huán)己烷9 mL，丁酮1 mL，反應(yīng)溫度為60℃，阿魏酸和油醇的摩爾比為1∶8，阿魏酸0.49 mg/mL，油醇 5.37 mg/mL，分子篩 5 mg/mL，黑曲霉脂肪酶0.25 g/mL，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，反應(yīng)12天時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值為91.0%。

3 結(jié)論

在雙有機(jī)溶劑體系中，建立了黑曲霉脂肪酶催化阿魏酸和油醇合成阿魏酸油醇酯的反應(yīng)體系。考察了酶濃度、反應(yīng)溫度和底物摩爾比等因素對(duì)阿魏酸酯化反應(yīng)的影響。在異辛烷/丁酮雙有機(jī)溶劑體系中，脂肪酶的濃度和底物酸醇摩爾比對(duì)阿魏酸轉(zhuǎn)化率的影響較大，反應(yīng)溫度對(duì)阿魏酸轉(zhuǎn)化率的影響較小，在最優(yōu)的反應(yīng)條件下阿魏酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)97.6%。在環(huán)己烷/丁酮雙有機(jī)溶劑體系中，溫度、脂肪酶濃度和底物酸醇摩爾比對(duì)阿魏酸轉(zhuǎn)化率的影響較大，在最優(yōu)的反應(yīng)條件下阿魏酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)91.0%。

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Esterification of Ferulic Acid by Aspergillus niger Lipase Catalysis in Binary Organic Solvents System

Liu Huan-zhen1，2，Wang Ming-zi1，2，Guo Ying-jia2，Zheng Li-fei2，Guo Zheng3，Xu Xue-bing3，Chen Bi-lian1，2
1(Engineering Research Center of Industrial Microbiology，Ministry of Education，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108，China)2(College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108，China)3(Faculty of Science，University of Aarhus，Aarhus，Denmark)

In binary organic solvents system，the esterification between ferulic acid and oleyl alchol was investigated，catalyzed by the native Aspergillus niger lipase.The effective factors，such as lipase concentration，temperature and the molar ratio of ferulic acid to oleyl alchol on the esterification were studied.The results indicated that in the isooctane/2-butanone solvents system，under the reaction conditions of Aspergillus niger lipase concentration 0.2 g/mL，temperature 60 ℃，the molar ratio of ferulic acid to oleyl alchol 1∶8，substrate concentration of ferulic acid 0.39 mg/mL，and oleyl alcohol 4.3 mg/mL，the conversion rate of esterification was 97.6%.Under the optimal condition in the cyclohexane/2-butanone solvents system which was:Aspergillus niger lipase concentration 0.25 g/mL，temperature 60 ℃，the molar ratio of ferulic acid to oleyl alchol 1∶8，the substrate concentrations of ferulic acid at 0.49 mg/mL and oleyl alcohol at 5.37 mg/mL，the conversion rate of esterification was 91.0% .

lipase，esterification，organic solvent，ferulic acid，oleyl alcohol

碩士(陳必鏈為通訊作者，Email:chenbil@fjnu.edu.cn)

*福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2007I0039，2008I0047)，教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助課題

2010-08-13，改回日期:2011-02-21