氧氣對茶多酚化學氧化合成茶黃素的影響*

張建勇，江和源，崔宏春，江用文

1(中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)部茶及飲料植物產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，浙江杭州，310008)2(杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院茶葉研究所，浙江 杭州，310024)

氧氣對茶多酚化學氧化合成茶黃素的影響*

張建勇1，江和源1，崔宏春2，江用文1

1(中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)部茶及飲料植物產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，浙江杭州，310008)2(杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院茶葉研究所，浙江 杭州，310024)

研究了O2對茶多酚化學氧化(堿性氧化和酸性氧化)形成茶黃素類物質(zhì)的影響。結果表明:在接近真空、露置空氣和通氧等3種不同O2含量的條件下，茶多酚堿性氧化和酸性氧化均可得到茶黃素類物質(zhì)，其含量隨著2種反應體系中O2含量的增加而增加，且化學氧化中兒茶素消耗的主體是EGCG、EGC、C、EC，說明O2是茶多酚化學氧化形成茶黃素的一個重要影響因素，而相關研究報道卻極少涉及到關于O2在茶多酚化學氧化合成茶黃素過程所發(fā)揮的作用;另外，比較茶多酚堿性氧化法和酸性氧化法形成茶黃素的情況，前者比后者得到更多茶黃素類物質(zhì)。文中還考察了O2對茶黃素化學氧化形成的影響。

O2，茶多酚，化學氧化，茶黃素，兒茶素，堿性氧化，酸性氧化

茶黃素是紅茶中的主要成分，是多酚類物質(zhì)氧化聚合形成的一類能溶于乙酸乙酯、具有苯駢卓酚酮結構的化合物的總稱［1］，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗病毒、抗突變及抗心腦血管疾病等［2－9，30］多種藥理功效。由于紅茶中茶黃素類含量較低(一般為0.3% ～1.5%［10］)，因此茶黃素類物質(zhì)主要通過兒茶素體外氧化途徑獲得。茶黃素體外氧化制備方法按催化劑的不同可分為酶促氧化法和化學氧化法2種?；瘜W氧化法是指利用化學氧化劑催化多酚類物質(zhì)氧化聚合形成茶黃素的方法，根據(jù)化學氧化劑種類的不同，又可分為堿性氧化和酸性氧化。與酶促氧化法相比，化學氧化法可消除酶提取純化困難、酶性質(zhì)不穩(wěn)定、反應時間較長等因素的影響，大大簡化反應體系，縮短反應時間，因而成為研究茶黃素形成機理的一種簡便而有效的方法。Roberts 等［11－24，26－27］對茶多酚化學氧化形成茶黃素進行了廣泛的研究，認為“在酶促氧化中，兒茶素與氧是反應底物，酶是催化劑，酶促反應時提高氧氣濃度，有利于茶黃素的形成和積累，但是卻極少涉及到關于O2在茶多酚化學氧化合成茶黃素過程所發(fā)揮的作用。在茶多酚酶促氧化體系中，O2是反應底物，是茶黃素形成的重要影響因素，但是化學氧化中O2對茶黃素形成的影響報道甚少。本文通過研究接近真空、露置空氣、通氧3種不同氧氣含量的條件下，茶多酚堿性氧化和酸性氧化2種反應體系中氧化產(chǎn)物中茶黃素的形成量，發(fā)現(xiàn)在化學氧化中，O2仍是影響茶多酚化學氧化形成茶黃素的一個重要因素，O2濃度的增加有利于茶黃素的形成和富集，這與很多學者的論斷不同。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

98%茶多酚(海南群力藥業(yè)有限公司);茶黃素(TF)、茶黃素-3-沒食子酸酯(TF-3-G)、茶黃素-3＇-沒食子酸酯(TF-3＇-G)、茶黃素-3，3＇-沒食子酸酯(TF-3，3＇-G)標準單體，均為本實驗室自制，HPLC純度分別為980.0、960.0、960.0、980.0 mg/g;乙腈(MECRO 色譜純)，乙酸、乙酸乙酯、檸檬酸、鐵氰化鉀、碳酸氫鈉、硝酸鐵，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器設備

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，MR3001型磁力攪拌器(德國 Heidoph公司)，KQ100E型醫(yī)用超聲波脫氣機(江蘇昆山醫(yī)用超聲儀器有限公司)，SHZ－D型循環(huán)水式真空泵(河南鞏義市英峪豫華儀器廠)，R－124型旋轉蒸發(fā)儀(德國BUCHI公司)，5510R型高速冷凍離心機(德國Eppendorff公司)，F(xiàn)A－210型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，818型pH計(美國奧立龍公司)，DHG－9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精密實驗設備有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 茶多酚化學氧化

堿性氧化法:配制10 mL堿性氧化劑溶液(K3Fe(CN)6 75 mg/mL和 NaHCO325 mg/mL)，以及50 mL茶多酚溶液(50 mg/mL)，將堿性氧化劑溶液加入茶多酚溶液中，磁力攪拌(轉速100 r/min)，分別在露置空氣(廣口容器自然敞開)、接近真空(0.09 MPa)、通氧(通入普通O25.0L/min)3種條件下分別反應15 min，溫度25℃(磁力攪拌器控溫±1℃)，反應結束后，200 μL檸檬酸水溶液(pH值1.79)終止反應，加入等體積冰乙酸乙酯(－10℃)萃取1次，靜止分層，酯層經(jīng)等體積Tris-HCl洗滌1次，合并酯層，放入4℃冰箱中待測。

酸性氧化法:配制10 mL酸性氧化劑溶液［Fe(NO3)3100 mg/mL］，以及50 mL茶多酚溶液(50 mg/mL)，將酸性氧化劑溶液加入茶多酚溶液中，磁力攪拌(轉速100 r/min)，分別在露置空氣(廣口容器自然敞開)、接近真空(0.09 MPa)、通氧(通入普通O25.0L/min)3種條件下分別反應15 min，溫度25℃(磁力攪拌器控溫±1℃)，反應結束后，立即加入等體積冰乙酸乙酯(－10℃)，萃取1次，靜止分層，，酯層經(jīng)等體積Tris-HCl洗滌1次，合并酯層，放入4℃冰箱中待測。

1.3.2 茶黃素HPLC分析

色譜柱為 Hypersil BDS C18(4.6 mmi.d×150 mm，5 μm)，流動相A為2%乙酸，流動相B為100%乙腈，流速1.5 mL/min，柱溫40℃，檢測波長380nm，進樣量5μL，梯度洗脫，流動相B在35 min內(nèi)由8%線性梯度變化到26%，40 min回到初始狀態(tài)，平衡5 min。

1.3.3 兒茶素HPLC分析

色譜柱為 Hypersil BDS C18(4.6 mmi.d×150 mm，5 μm)，流動相A為2%乙酸，流動相B為100%乙腈，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長280nm，進樣量5μL，梯度洗脫，流動相 B在 12 min內(nèi)由6.5%線性梯度變化到8%，16 min變化到15%，20 min變化到25%，26 min回到初始狀態(tài)，平衡5 min。

2 結果與分析

2.1 茶多酚堿性氧化和酸性氧化

本實驗選擇了接近真空、露置空氣、通氧3種不同O2含量的條件，對茶多酚進行化學氧化，考察O2的含量對茶多酚化學氧化的影響。以茶多酚堿性氧化反應液經(jīng)乙酸乙酯和Tris-HCl處理后的酯相HPLC圖譜(圖1)為例，可以看出，茶多酚化學氧化體系在露置空氣、接近真空、通氧3種環(huán)境條件均可以得到茶黃素(TF)、茶黃素-3-沒食子酸酯(TF-3-G)、茶黃素-3＇-沒食子酸酯(TF-3＇-G)、茶黃素-3，3＇-沒食子酸酯(TF-3，3＇-G)4種主要茶黃素類物質(zhì)，且這4種茶黃素的形成呈逐漸遞增的趨勢，說明O2含量的高低影響茶黃素類的物質(zhì)形成，而 Takeo等［11－23］學者的研究卻極少提到茶多酚化學氧化中O2的參與作用。

另外，從實驗現(xiàn)象來看，在接近真空、露置空氣、通氧3種不同O2含量的條件下，茶多酚化學氧化反應液顏色逐漸加深變紅，說明隨著O2含量的增加，反應液中有色物質(zhì)含量也在增加。其次，從圖1中HPLC的出峰情況來看，接近真空、露置空氣、通氧3種條件下茶多酚化學氧化產(chǎn)物的組分類似，說明本實驗條件下O2只對茶黃素類物質(zhì)的形成量有較大影響，而對所形成的色素類物質(zhì)的組成影響較小。

圖1 三種條件下茶多酚堿性氧化反應液HPLC圖譜(380nm)

2.2 茶黃素形成和兒茶素消耗的分析

為了深入探討O2對茶多酚化學氧化的影響，分析了接近真空、露置空氣、通氧3種不同O2含量條件下，茶多酚堿性氧化反應液和酸性氧化反應液中茶黃素形成和兒茶素消耗情況，以進一步分析O2在茶黃素形成的重要作用，詳見表1～表3。

由表1可知，在茶多酚堿性氧化和酸性氧化2種反應體系中，接近真空、露置空氣、通氧3種不同O2含量條件下的化學氧化反應產(chǎn)物中均含有茶黃素類物質(zhì)，且其含量分別隨著2種反應體系中O2含量的增加而增加，以通氧條件下茶多酚堿性氧化反應液中4種主要茶黃素總量最高，進一步說明了O2是茶多酚化學氧化反應體系中的一個重要影響因素，可促進反應產(chǎn)物中茶黃素的形成。

比較通氧時茶黃素形成量分別與接近真空和露置空氣時茶黃素形成量的比值，可以發(fā)現(xiàn)，通氧條件下的4種主要茶黃素總量比接近真空條件下的均可提高4.1倍，比露置空氣中可分別提高3.5倍和2.4倍，而對于不同茶黃素組分而言，茶多酚堿性氧化反應液中TF-3，3'-G的“通氧/接近真空”和“通氧/露置空氣”2種比值最高，分別達到6.7和4.7，說明O2對4種主要茶黃素中的TF-3，3'-G形成影響最大。有關研究表明［29－32］，4 種主要茶黃素中雙酯型茶黃素(TF-3，3'-G)的生物活性最高，其對于保證茶黃素類產(chǎn)品的高生物活性極為必要。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在茶多酚堿性氧化反應液中通入O2，可顯著提高反應體系TF-3，3’-G，因此可為獲得高活性茶黃素類產(chǎn)品提供借鑒。

同時，比較茶多酚堿性氧化和酸性氧化反應產(chǎn)物中茶黃素的形成量，發(fā)現(xiàn)前者比后者均可得到更多的茶黃素，且露置空氣、接近真空、通氧3種不同O2含量條件下，前者4種主要茶黃素總量分別是后者的2.9倍、2.0倍、2.9倍，說明茶多酚堿性氧化法比酸性氧化法更有利于茶黃素類物質(zhì)的形成，因此，與堿性氧化法相比，盡管酸性氧化法是一種比較特別的茶黃素制備途徑，但是就目前而言，茶多酚堿性氧化仍是化學氧化制備茶黃素的主要方法。

表1 不同O2含量對茶黃素形成的影響

由表2和表3中各兒茶素組分消耗率可知［兒茶素消耗率=(原液中兒茶素-反應后溶液兒茶素)/原液中兒茶

素)］，在接近真空、露置空氣、通氧3種不同O2含量條件下，無論是堿性氧化，還是酸性氧化，8種兒茶素總量的消耗率均隨O2含量的增加而增加，且堿性氧化的兒茶素總量消耗率大于酸性氧化的兒茶素總量消耗率，這與前述的茶黃素形成量變化規(guī)律相對應，即氧化產(chǎn)物中茶黃素形成量較高時，兒茶素殘留量相對則較低，反之亦然。

另外，比較各個兒茶素組分的消耗率，可以發(fā)現(xiàn)，茶多酚堿性氧化和酸性氧化的主體均是 EGCG、EGC、C、EC，以 EGCG的消耗率最高，其他4種兒茶素也有不同程度的消耗。不論是酶促氧化還是化學氧化，氧化的主體是EGCG和EGC，大部分EC也被氧化，且在酶促氧化中，大部分ECG被氧化［26］，但在本實驗的茶多酚堿性氧化和酸性氧化反應體系中，ECG消耗的并不多。

表2 不同O2含量對茶多酚堿性氧化反應液中兒茶素的影響

表3 不同O2含量對茶多酚酸性氧化反應液中兒茶素的影響

3 討論

Bokuchava等［25］于1951年提出茶色素的形成機理假設:兒茶素+O2→鄰醌+H2O，鄰醌→有色產(chǎn)物。由于在O2的存在下，PPO對兒茶素的氧化，導致醌類的形成，從而生成茶黃素、茶色素及茶褐素等茶色素類物質(zhì)。這一理論被后來的體外氧化實驗所證實。因此，兒茶素的酶促氧化是一個需氧過程，且O2是酶促反應底物，是茶黃素形成的重要影響因素。自Roberts［11］首次以 K3Fe(CN)6和 NaHCO3為化學氧化劑進行兒茶素體外模擬化學氧化實驗以來，Collier［12－23］等發(fā)現(xiàn)，兒茶素化學氧化同樣可形成具有苯駢卓酚酮結構的茶黃素類物質(zhì)，由于化學氧化劑同樣可以氧化多酚的鄰位二羥基而形成鄰醌，而鄰醌以后的縮聚反應系非酶促作用，并且經(jīng)鄰醌形成聯(lián)苯酚醌后所發(fā)生的歧化作用均系非酶促反應，因此可發(fā)生氧化縮聚而形成苯駢卓酚酮類物質(zhì)。這一點對研究兒茶素的氧化機理以及茶黃素的生產(chǎn)具有十分重要的理論價值。然而，這些理論僅僅考慮化學氧化劑的催化作用，卻極少考慮 O2可能起到的作用。在Bokuchava提出的經(jīng)典茶色素形成理論中，兒茶素是在氧氣的參與下形成鄰醌，再形成色素類物質(zhì)的，本研究以此為切入點，通過比較分析O2對茶多酚化學氧化反應的影響發(fā)現(xiàn)，在其它條件相同的條件下，增加O2的量，反應液顏色逐漸加深，且HPLC檢測顯示茶黃素類物質(zhì)形成量顯著增加，說明O2在兒茶素化學氧化時也發(fā)揮著重要的作用，推測其影響機理，O2可能通過促進化學氧化劑氧化多酚的鄰位二羥基形成鄰醌而促進茶黃素類物質(zhì)的形成，但是否作為反應物直接參與茶黃素的形成有待于進一步研究。

另外，本研究中茶多酚化學氧化HPLC圖譜顯示，除茶黃素(TF)、茶黃素-3-沒食子酸酯(TF-3-G)、茶黃素-3＇-沒食子酸酯(TF-3＇-G)、茶黃素-3，3＇-沒食子酸酯(TF-3，3＇-G)4種主要茶黃素類物質(zhì)色譜峰以外，還有較多峰面積較大的未知色譜峰，這就預示著對應的是一些復雜的未知茶多酚化學氧化產(chǎn)物，可能是一些未知的茶黃素、茶紅素或者茶褐素等色素類物質(zhì)，可以利用柱層析法、高速逆流色譜法等分離純化技術和質(zhì)譜、紅外光譜及核磁共振波譜技術相結合，明確這些未知氧化產(chǎn)物的特性和結構，并有利于深入分析O2對復雜的茶多酚化學氧化產(chǎn)物形成的影響。

［1］ 宛曉春主編.茶葉生物化學(第三版)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2003:192.

［2］ Arghya A，Suchismita M，Lakshmishri L，et al.Theaflavins retard human breast cancer cell migration by inhibiting NF-κB via p53-ROS cross-talk［J］.FEBS Letters，2010，584(1):7－14.

［3］ Cheng Peng，Ho Yin Edwin Chan，Yuk Man Li，et al.Black tea theaflavins extend the lifespan of fruit flies［J］.Experimental Gerontology.2009，44(12):773－783.

［4］ Kapil S，Shamsher S Bari，Harsh P Singh，et al.Biotransformation of tea catechins into theaflavins with immobilized polyphenol oxidase［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic.2009，56(4):253－258.

［5］ Yang Ziyin，Jie Guoliang，F(xiàn)ang Dong，et al.Radical-scavenging abilities and antioxidant properties of theaflavins and their gallate esters in H2O2－mediated oxidative damage system in the HPF-1 cells［J］.Toxicology in Vitro.2008，22(5):1 250－1 256.

［6］ Wang Kunbo，Liu Zhonghua，Huang Jian-an，et al.Preparative isolation and purification of theaflavins and catechins by high-speed countercurrent chromatography［J］.Journal of Chromatography B.2008，867(2):282－286.

［7］ Neetu K，Kavita S，Sahdeo P，et al.Theaflavins induced apoptosis of LNCaP cells is mediated through induction of p53，down-regulation of NF-kappa B and mitogen-activated protein kinases pathways［J］.Life Sciences.2007，80(23):2 137－2 146.

［8］ Prasad S，Kaur J，Roy P，et al.Theaflavins induce G2/M arrest by modulating expression of p21waf1/cip1，cdc25C and cyclin B in human prostate carcinoma PC-3 cells［J］.Life Sciences.2007，81(17/18):1 323－ 1 331.

［9］ Babli H，Swapan P，Sibabrata M，et al.Anticlastogenic effects of black tea polyphenols theaflavins and thearubigins in human lymphocytes in vitro［J］.Toxicology in Vitro.2006，20(5):608－613.

［10］ 楊賢強，王岳飛，陳留記.茶多酚化學［M］.上海:上?？茖W技術出版社，2003:33－38.

［11］ Roberts E A H.The phenolic substances of f manufactured tea(I)［J］.J Sci Food Agric，1957，8:72 －80.

［12］ Collier P D，Mallows R，Korver O et al.The theaflavins of black tea［J］.Tetrahedon，1973，29:125 －142.

［13］ Takeo T.Studies on the mechanism of the oxidation of tea catechins［J］.Photoehemistry，1981，20(9):2 145 －2 147.

［14］ Wan Xiaochun，Harry E Nursten，Cai Ya，et al.A new type of tea pigments-from the chemical oxidation of epicatechin gallate and isolated from tea［J］.J Sci Food Agric，1997(74):401－408.

［15］ Davies M J，Judd J T，Baer D J，et al.Black tea consumption reduces total and LDL cholesterol in mildly hypercholesterolemia adults［J］.J Nutr，2003，133(10):3 298－3 302.

［16］ Nonaka G J.Tannins and related compounds XXXVI，isolation and structures of theaflagallins，New red pigments from black tea ［J］.Chen Pharm bull，1986，34(1):61－65.

［17］ Sang S，Tian S.New dibenzotropolone derivatives characterized from black tea using LC/MS/MS［J］.Bioorg Med Chem，2004，12:3 009－3 017.

［18］ 蕭偉祥，宛曉春，胡耀武.茶兒茶素體外氧化產(chǎn)物分析［J］.茶葉科學，1999，19(2):145 －149.

［19］ 李大祥.茶兒茶素化學氧化的研究［D］.合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學，2000.

［20］ 李大祥，宛曉春，蕭偉祥.兒茶素化學氧化條件的研究簡報［J］.茶業(yè)通報，2000，22(2):17－18.

［21］ 李大祥，宛曉春.論兒茶素的化學氧化［J］.茶業(yè)通報，2000，22(3):22－23.

［22］ 李立祥.茶多酚氧化實驗研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2002，25(2):101 －104.

［23］ 李立祥.酸性條件對茶多酚酸性氧化的影響［J］.中國茶葉加工，2003(2):28－30.

［24］ 黃海濤，屠幼英.兒茶素體外氧化制取茶黃素的研究進展［J］.中國茶葉，2003(6):15－16

［25］ Bokuchava M著，阮宇成譯.制茶工藝學與生物化學［M］.杭州:中國農(nóng)業(yè)科學院茶科所情報資料室，1982.

［26］ 張建勇，江和源，江用文.咖啡堿和蛋白質(zhì)對酯型兒茶素氧化形成TFDG的影響［J］.茶葉科學，2007，27(3):185－191.

［27］ 張建勇.酯型茶黃素化學氧化形成的影響因素及其機理研究［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學院，2007.

［28］ 江和源，Hang Xiao，袁新躍，等.茶黃素雙沒食子酸酯的抗癌活性及其作用機理研究［J］.茶葉科學，2007，27(1):33－38.

［29］ Sang Shengmin，Tian Shiying，Jhoo Jinwoo，et al.Chemical studies of the antioxidant mechanism of theaflavins:radical reaction products of theaflavin 3，3'-digallate with hydrogen peroxide［J］.Tetrahedron Letters.2003，44(30:5 583－5 587.

［30］ Babich H，Pinsky S M，Muskin E T，et al.In vitro cytotoxicity of a theaflavin mixture from black tea to malignant，immortalized，and normal cells from the human oral cavity［J］.Toxicology in vitro.2006，20(5):677 －688.

［31］ Schuck A G，Ausubel M B，Zuckerbaun H L，et al.Theaflavin-3，3＇-digallate，a component of black tea:An inducer of oxidative stress and apoptosis［J］.Toxicology in Vitro，2008，22(3):598－609.

［32］ Lu Jiebo，Alexander G Alice，Liu Yeechang，et al.PCR differential display-based identification of regulator of G protein signaling 10 as the target gene in human colon cancer cells induced by black tea polyphenol theaflavin monogallate［J］.European Journal of Pharmacology，2008，601(1－3):66－72.

The Impact of Oxygen on Theaflavins Synthesis by Chemical Oxidation of Tea Polyphenol

Zhang Jian-yong1，Jiang He-yuan1，Cui Hong-chun2，Jiang Yong-wen1
1(Tea Research Institute of CAAS，Key Laboratory of Tea and Beverage Plant Products Processing and Quality Control of Agriculture Ministry，Hangzhou 310008，China)2(Tea Research Institute of Hangzhou Academy of Agriculture，Hangzhou 310024，China)

This study is focused on the impact of oxygen on chemical oxidation(alkalinity oxidation，acidity oxidation)of tea polyphenol.The results showed that the theaflavin could be obtained by alkali oxidation or acid oxidation of tea polyphenol in three conditions:vacuum，air exposing and oxygen infusion.The more oxygen in the reaction，the more theaflavins were produced.Furthermore，the principal part of chemical oxidation were EGCG、EGC、C、EC.Therefore，oxygen was the important factor in the reaction of chemical oxidation of tea polyphenol.But this was rarely reported.In addition，the yield of alkali oxidation was more than the acid oxidation.This paper reviews the impact of oxygen on chemical oxidation in the preparation of theaflavins for the first time.It lays the foundation for indepth study of mechanism and preparation of theaflavins formation.

oxygen，tea polyphenol，chemical oxidation，theaflavins，catechins，alkalinity oxidation，acidity oxidation

碩士，助理研究員(江和源為通訊作者)。

*現(xiàn)代農(nóng)業(yè)茶葉產(chǎn)業(yè)技術體系紅茶加工崗位;基本科研業(yè)務費專項(0032010033);國家863項目(2007AA10Z303)。

2010－10－15，改回日期:2011－02－24