高溫變性豆粕酶改性過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化*

任為聰，程建軍，張智宇，趙偉華，江連洲，2

1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱，150030)2(國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱，150030)

高溫變性豆粕酶改性過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化*

任為聰1，程建軍1，張智宇1，趙偉華1，江連洲1，2

1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱，150030)2(國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱，150030)

研究了高溫變性豆粕(HDDSF)酶改性過程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，分析了高溫變性豆粕蛋白質(zhì)溶解性提高與結(jié)構(gòu)的關(guān)系。在不同水解度(DH)下，檢測(cè)酶改性處理前后的可溶性蛋白質(zhì)的的表面巰基(SSH)、自由巰基(FSH)、總巰基(TSH)、二硫鍵(-S-S-)和表面疏水性(H0)，通過SDS-PAGE圖譜分析蛋白亞基變化。隨著DH的提高，高溫變性豆粕蛋白質(zhì)溶解性增加，自由巰基和表面疏水性下降，總巰基和二硫鍵先上升后下降。經(jīng)酶改性后蛋白質(zhì)溶解性明顯提高，酶解促使高溫變性豆粕的不溶性蛋白質(zhì)生成了以二硫鍵為主要化學(xué)鍵連接的可溶性聚合物，在酶繼續(xù)作用下，生成的聚合物被最終酶解。

高溫變性豆粕，酶改性，二硫鍵，表面疏水性

高溫變性豆粕是大豆煉油后的副產(chǎn)物，煉油工藝中高溫脫溶步驟會(huì)造成蛋白質(zhì)的熱變性，導(dǎo)致溶解性較差。蛋白質(zhì)許多重要的功能特性依賴于蛋白質(zhì)的溶解性得以體現(xiàn)［1］。通過酶法改性可以提高蛋白質(zhì)的溶解性。對(duì)酶改性過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析比較，有助于了解此過程中的反應(yīng)機(jī)理，具有一定的理論指導(dǎo)意義。酶解技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，Jens［2］依據(jù) Linderstrom-Lang 的理論提出了酶解蛋白質(zhì)的模型，并指出在此過程中蛋白質(zhì)的溶解性受到蛋白質(zhì)變性程度和酶的影響。此后國(guó)內(nèi)外研究者利用植物性蛋白酶［3－4］、動(dòng)物性蛋白酶［5－8］和微生物蛋白酶［9－11］改性不同來源的蛋白質(zhì)，以提高蛋白質(zhì)的溶解性。酶改性起始階段由于加熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚合物［5］，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，聚合物消失，蛋白質(zhì)可電離氨基酸和羧基基團(tuán)大量暴露，增強(qiáng)了與水的結(jié)合作用［4，6］。巰基和二硫鍵作為維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)重要的組成部分［12］，一直是檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的一種方法。Hsu和 Wang［13－14］通過對(duì)高壓處理后的羅非魚和大豆分離蛋白的巰基進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)含量明顯減少，證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變的松散。對(duì)熱處理［15］等其他處理后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，同樣可以通過對(duì)巰基的檢測(cè)進(jìn)行分析。Groleau［16］通過對(duì)酶解后的乳蛋白聚合物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，二硫鍵是形成聚合物的主要因素。Wagner［17］認(rèn)為，蛋白質(zhì)的溶解性受到多種因素影響，可通過檢測(cè)表面疏水性來完成。酶解產(chǎn)物的濁度能反映出在其溶液中的聚集程度，Doucet［18］發(fā)現(xiàn)經(jīng)Alcalase蛋白酶酶解后的乳清蛋白，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物在pH 3.0～5.0范圍內(nèi)的濁度減小，聚集物減少。考慮到酶解是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過程，因此結(jié)合前人的研究結(jié)論和方法，對(duì)酶解過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行詳細(xì)的分析。將酶解技術(shù)引入到改性高溫變性豆粕中，通過酶解過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中巰基和二硫鍵的檢測(cè)，試討論酶改性提高高溫變性豆粕溶解性的機(jī)理性問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高溫變性豆粕:黑龍江省雙鴨山市楊霖油脂廠。

1.2 試驗(yàn)儀器及試劑

HYP－2型消化爐，上海纖檢儀器有限公司;恒溫水浴鍋，余姚市東方電工儀器廠;電動(dòng)攪拌槳，金壇市中大儀器廠;飛鴿TDL－40B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;PHS－3C酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠;TDW馬弗爐，溫州市雙嶼儀器廠;722型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;4500型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司;B－290型噴霧干燥機(jī)，瑞士Buchi公司。

Alaclase蛋白酶(實(shí)測(cè)酶活力198 638.3 U/mL)，丹麥Novo公司;Tris、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)，Sigma 公司;甘氨酸、β-巰基乙醇、5，5＇-二巰基二硝基苯甲酸(DTNB)、EDTA，Amresco公司;14.4～97.4 ku蛋白Marker，中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所;3，5-二硝基水楊酸(DNS)，為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高溫變性豆粕成分及可溶性蛋白質(zhì)測(cè)定方法

蛋白質(zhì)溶解性=上清液蛋白質(zhì)含量/樣品總蛋白含量;蛋白質(zhì)含量測(cè)定(GB 5009.5－2003);粗脂肪測(cè)定(GB 5009.6－2003);灰分測(cè)定(GB 5009.4－2003);水分測(cè)定(GB 5009.6－2003);粗纖維測(cè)定(GB 5009.10 －2003);總糖含量測(cè)定參考文獻(xiàn)［19］;酶活力測(cè)定:按照福林－酚法(SB/T 10317－1999);DH測(cè)定:pH－stat方法參照文獻(xiàn)［20］。

1.3.2 堿性蛋白酶改性過程

粉碎過80目篩的原料→加水調(diào)節(jié)適當(dāng)濃度→調(diào)節(jié)適當(dāng)pH值→加堿性蛋白酶→用2 mol/L的NaOH調(diào)pH值進(jìn)行水解→酶解液→沸水浴滅酶活10 min→離心分離(5 000 g，10 min)→測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量→上清液噴霧干燥。

1.3.3 電泳檢測(cè)

參照 Laemmli［21］提出的方法，具體方法如下:選取12%分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行還原和非還原電泳(上樣緩沖液中不添加β-巰基乙醇)。電泳前樣品沸水浴處理5 min，吸取10 μL樣品上樣，選取Marker范圍為14.4～97.4 ku。起始電壓70 V，待樣品進(jìn)入分離膠，調(diào)整電壓為120 V。染色劑為2.5 g/L考馬斯亮藍(lán)R－250(甲醇∶水∶冰乙酸體積比為23∶23∶4)的混合溶液，脫色劑為(甲醇∶水∶冰乙酸體積比為9∶9∶2)混合溶液。

1.3.4 表面巰基與自由巰基含量的測(cè)定

表面巰基與自由巰基含量的測(cè)定依據(jù)Ellman［22］提出的理論，參照Tang［23］的方法進(jìn)行測(cè)定的，具體方法如下:取不同DH的噴霧干燥樣品溶于4 mL Tris－甘氨酸緩沖溶液中(Tris 0.086 mmol/L，甘氨酸0.09 mol/L，EDTA 4 mmol/L，pH8.0)，樣品濃度達(dá)到 5 mg/mL，再加入50 μL Ellman顯色劑(4 mg DTNB 溶于1 mL的緩沖溶液中)，在室溫下(25℃)反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后在13600 g條件下高速離心10 min，在412 nm下測(cè)定吸光值，不添加樣品的溶液作為空白。測(cè)定自由巰基含量時(shí)，在Tris-甘氨酸緩沖溶液中再加入8 mol/L的尿素和5 g/L的SDS，測(cè)定方法如同表面巰基。巰基含量依據(jù)Beveridge［24］提出的公式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.5 總巰基和二硫鍵的測(cè)定

測(cè)定 ss鍵的方法依據(jù) Tannhauser［25］提出的理論，參照Tang［23］的方法進(jìn)行測(cè)定。NTSB溶液合成方法:DTNB(0.1 g)溶于1 mol/L Na2SO3中，調(diào)節(jié)pH為7.5。加入50 μL 0.1 mol/L的硫酸銅銨溶液，在38℃水浴下攪拌直至溶液顏色成淺黃色，20℃貯藏。NTSB與二硫鍵反應(yīng)生成的NTB在412nm下可測(cè)其吸光值。NTSB溶液與pH 9.5的0.2 mol/L tris緩沖溶液(Tris 0.2 mol/L甘氨酸 0.09 mol/L，EDTA，10 mmol/L，尿素 8 mol/L，SDS 5 g/L 和 Na2SO30.1 mol/L)以1∶100的比例混合，備用。將不同DH的噴霧干燥樣品溶于0.2mol/L tris緩沖溶液中，濃度為25 mg/mL。取0.1 mL樣品溶液與3 mL的NTSB混合緩沖液相混合，室溫下(25℃)反應(yīng)25 min，在412 nm下測(cè)其吸光值，二硫鍵含量=(總巰基－自由巰基)/2。

1.3.6 表面疏水性測(cè)定

參照Wagner［17］的方法利用 ANS作為熒光探針測(cè)定不同DH樣品的表面疏水性H0，具體方法如下:樣品溶于0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 7.0)中，制成0.0125% ～0.1%(w/v)的溶液。25 μL的ANS溶液(溶于相同緩沖溶液制成8.0 mmol/L的溶液)添加到5 mL的樣品溶液中，避光反應(yīng)15 min。在360 nm(激發(fā)波長(zhǎng))，490 nm(發(fā)射波長(zhǎng))的條件下進(jìn)行測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度。以樣品濃度和熒光強(qiáng)度作圖，斜率即為表面疏水性H0。

1.3.7 濁度分析

依據(jù) Groleau［16］的方法。選取 pH3.0～10.0的不同緩沖溶液(0.1 mol/L的檸檬酸溶液與0.2 mol/L的Na2HPO4溶液配制pH 3.0，4.0，5.0的緩沖液;0.2 mol/L的Na2HPO4溶液與0.2 mol/L的NaH2PO4溶液配制 pH 6.0，7.0，8.0的緩沖液;0.1 mol/L的Na2CO3溶液與0.1 mol/L的NaHCO3溶液配制pH 9.0，10.0的緩沖液)將不同DH樣品配制成1%的溶液，室溫下(25℃)下平衡1 h后，在500 nm條件下測(cè)定吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;采用SPSS 13.0進(jìn)行相關(guān)分析;采用origin 8.0進(jìn)行作圖處理。

2 結(jié)果

2.1 高溫變性豆粕部分指標(biāo)測(cè)定

由表1可知，高溫變性豆粕的蛋白質(zhì)含量(干基)可達(dá)到49%左右，蛋白質(zhì)資源豐富，但其可溶性蛋白質(zhì)含量?jī)H占蛋白質(zhì)總量的21%左右，由于熱變性的原因，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，肽鏈松散，大部分疏水基團(tuán)大量暴露在蛋白質(zhì)肽鏈外部，這是導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性下降的根本原因［1］。

表1 原料主要成分指標(biāo)分析結(jié)果

2.2 不同DH對(duì)高溫變性豆粕溶解性的影響

由圖1可知，隨著酶解的開始，與原料溶解性相比，在DH1%時(shí)高溫變性豆粕的溶解性急劇上升，溶解性從21.24%提高到72.65%，提高了51.41%，隨后溶解性緩慢地提高;當(dāng)DH達(dá)到12%時(shí)，溶解性達(dá)到88.33%，隨后變化不再顯著(P＜0.05)，與原料相比溶解性提高了67.09%。酶解過程中，高度變性的高溫變性豆粕蛋白質(zhì)在酶的作用下，被酶解成較長(zhǎng)肽鏈溶于水中，隨著肽鏈繼續(xù)被酶解，長(zhǎng)肽鏈被進(jìn)一步酶解為分子量更小的短肽［6］，因此，通過控制DH值可以達(dá)到控制高溫變性豆粕的溶解性。

圖1 DH對(duì)高溫變性豆粕溶解性的影響

2.3 不同DH的高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)SDSPAGE電泳分析

利用SDS-PAGE電泳對(duì)酶解過程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行進(jìn)一步的分析。由圖2(a)還原型電泳圖譜可知，β-半球蛋白的 α和 α＇亞基首先被酶解，DH為1%時(shí)便被酶解消失，在分子量為20.1～31.0 ku之間形成新條帶;β-半球蛋白的β亞基和球蛋白的A亞基條帶在圖譜上隨DH的提高而減弱，當(dāng)DH為10%時(shí)條帶在圖譜上消失;球蛋白的B亞基條帶也呈減弱趨勢(shì)，但在DH為14%時(shí)，仍可見部分未酶解的B亞基條帶。

由于非還原電泳樣品緩沖液中不含有β-巰基乙醇，因此蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵未被破壞，見圖2(b)。隨酶解的進(jìn)行，在43.0～66.2 ku形成了新條帶，此條帶為通過二硫鍵連接的AB亞基聚合物［26－27］，在DH為10%時(shí)被酶解消失。其他亞基條帶隨DH的提高均呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，形成了分子量更小的肽而聚集在譜圖的最下端。

圖2 不同DH的高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)還原型(a)與非還原型(b)SDS-PAGE電泳分析

2.4 不同DH對(duì)高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)巰基與二硫鍵的影響

由圖3可知，隨著DH的提高，表面巰基(SSH)先由對(duì)照樣的3.70 μmol/g下降到8%時(shí)的1.99 μmol/g隨后再次上升到2.39 μmol/g，而自由巰基(FSH)一直呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，從5.92 μmol/g下降到DH為 6%時(shí)的 4.04 μmol/g，并趨于平緩(P＜0.05)?？値€基(TSH)和二硫鍵(－S－S－)隨著酶解的開始，在DH為1%時(shí)急劇上升，分別從15.79 μmol/g 和 6.71 μmol/g 上 升到 25.29 μmol/g 和20.67 μmol/g，隨后隨DH的提高而下降，最終下降到 13.91 μmol/g 和 9.81 μmol/g，證明先形成了依靠二硫鍵連接的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，隨后逐漸被破壞。巰基和二硫鍵的變化，可以反映蛋白質(zhì)在此酶解過程中的結(jié)構(gòu)變化，隨著酶解的進(jìn)行，形成巰基和二硫鍵的半胱氨酸殘基被酶破壞，使得在整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.5 不同DH對(duì)高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

由圖4可知，酶解對(duì)高溫變性豆粕蛋白質(zhì)的表面疏水性產(chǎn)生影響。隨著酶解的開始，與原料相比，在DH為1%時(shí)表面疏水性急劇下降，從596.6下降到341.67，證明酶解對(duì)其破壞顯著，隨后在DH為6%時(shí)下降到255.94并趨于平緩(P＜0.05)，而后在DH為14%時(shí)再次下降，這可能由于酶解使得疏水性氨基酸殘基含量減少并達(dá)到短時(shí)的平衡，隨DH的再次提高，破壞了這種平衡，使得疏水性氨基酸殘基的含量再次下降。

圖3 不同DH對(duì)高溫變性豆粕巰基與二硫鍵的影響

圖4 不同DH對(duì)高溫變性豆粕表面疏水性的影響

2.6 pH值對(duì)高溫變性豆粕各水解產(chǎn)物濁度的影響

由圖5可知，隨DH的提高，樣品在各pH值條件下濁度的吸光度均下降。所有樣品在pH值3.0～5.0時(shí)的濁度，高于pH值6.0～10.0時(shí)的濁度，對(duì)照樣與DH為1%、2%、4%、6%的樣品在pH值4.0時(shí)濁度到達(dá)最高，隨后下降，而濁度為8%、10%、12%和14%的樣品隨pH值上升，濁度一直下降;當(dāng)pH值6.0后，所有樣品濁度下降均趨于平緩(P＜0.05)。由于大豆蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在4.5左右，在此pH區(qū)間蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，濁度較大，隨DH的提高，酶對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞加深，使得酶解產(chǎn)物在大豆蛋白等電點(diǎn)附近的濁度下降。

圖5 不同pH對(duì)各水解產(chǎn)物濁度的影響

3 討論

不同DH的高溫變性豆粕酶解產(chǎn)物在蛋白結(jié)構(gòu)上有明顯的差異，因此直接影響其溶解性。在酶解的開始階段，β-半球蛋白的各亞基最先被破壞(見圖2)，表面巰基、自由巰基的下降，總巰基的上升，說明外部巰基沒有轉(zhuǎn)移至內(nèi)部，而是蛋白質(zhì)之間的表面巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，使蛋白質(zhì)相互結(jié)合，形成可溶性聚集物(見圖2b)。Groleau［16］認(rèn)為，乳蛋白的酶解物通過非共價(jià)鍵(疏水作用力)和共價(jià)鍵(二硫鍵)共同作用形成了聚合物，但聚合物的形成受到離子強(qiáng)度、pH和溫度等多方面因素的共同影響。Doucet［18］則認(rèn)為酶解形成聚合物的反應(yīng)與類蛋白反應(yīng)十分相似，二硫鍵不是形成聚合物的重要因素，疏水作用力、氫鍵和靜電相互作用是形成重要因素。

每個(gè)大豆球蛋白中存在6對(duì)由A和B亞基通過二硫鍵相互連接形成的亞基對(duì)［28］，因此天然大豆蛋白的二硫鍵主要集中在大豆球蛋白中。隨著酶解的繼續(xù)進(jìn)行，大豆球蛋白A、B兩亞基(見圖2a)和AB聚合物(見圖2b)開始被酶解，自由巰基、總巰基和二硫鍵下降(見圖3)，說明在酶的作用下，形成巰基和二硫鍵的半胱氨酸殘基被酶破壞，當(dāng)聚合物和A、B兩亞基結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)部的半胱氨酸殘基被暴露在外部，造成表面巰基的再次上升。不同DH的高溫豆粕酶解產(chǎn)物在大豆蛋白等電點(diǎn)附近濁度的下降，進(jìn)一步說明了酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的變化，它們之間的相互作用在酶的作用下在減弱。

本研究中，表面疏水性一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，形成的聚合物表面疏水性氨基酸殘基較少，說明整個(gè)過程中疏水性氨基酸殘基一直被破壞，蛋白質(zhì)分子量變小(見圖2)。這與 Guan［6］的結(jié)論一致，Guan認(rèn)為破壞致密的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子量的減少，以及帶電荷的親水基團(tuán)的大量暴露，疏水基團(tuán)的減少是酶解提高蛋白質(zhì)溶解性的重要過程。其他研究者同樣認(rèn)為親水基團(tuán)的大量暴露是酶解提高蛋白質(zhì)溶解性的原因［3，5］。

4 結(jié)論

(1)隨DH的提高，酶改性后的高溫變性豆粕蛋白質(zhì)溶解性明顯提高。

(2)酶解過程中，高溫變性豆粕的表面疏水性不斷下降;濁度隨pH的上升呈下降趨勢(shì);不溶性蛋白質(zhì)形成了以二硫鍵為主要化學(xué)鍵連接的可溶性聚合物;隨著酶解的進(jìn)一步進(jìn)行，可溶性聚合物結(jié)構(gòu)被酶破壞，蛋白質(zhì)分子量減小，二硫鍵含量下降。

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Effect of Enzymic Modification Treatment on Structural Characteristics of Commercial Highly Denatured Defatted Soy Flakes

Ren Wei-cong1，Cheng Jian-jun1，Zhang Zhi-yu1，Zhao Wei-hua1，Jiang Lian-zhou1，2
1(College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)2(National Soybean Engineering and Technique Research Center，Harbin 150030，China)

The effects of enzymatic modification(EM)treatment on structural characteristics of highly denatured defatted commercial soy flakes(HDDSF)were investigated in order to analyze the relationship between its solubility and structure.Protein solubility，surface hydrophobicity(Ho)，surface sulfhydryl(SSH)content，free sulfhydryl(FSH)content，total sulfhydryl(TSH)content and disulfide bond(－S－S－)content were evaluated.Protein subunits profiles for the hydrolysate were altered by the EM treatment and major changes were observed for the hydrolysate.With DH increasing，the solubility of HDDSF was increased significantly.The SSH content，F(xiàn)SH content and the TSH content were showed different changes，above all the －S－S－ content of HDDSF was significantly increased after EM treatment at DH1%，but was gradually decreased with further increase in DH.Analysis showed that the soluble aggregates were formed during EM treatment.Covalent interactions(i.e.disulfide bonds)was involved in the formation of soluble aggregates.The formation of soluble aggregates significantly improved the solubility of HDDSF，and the soluble aggregates were hydrolyzed by Alaclase thereafter.

highly denatured defatted soy flakes，enzymic modification treatment，disulfide bond content，surface hydrophobicity(Ho)

碩士研究生(程建軍副教授為通訊作者)。

*黑龍江省科技計(jì)劃項(xiàng)目任務(wù)書(GB08B401－02)

2010－12－28，改回日期:2011－02－10