溶氧調(diào)控策略對(duì)Alcaligenes sp.NX-3產(chǎn)威蘭膠發(fā)酵過程的影響*

萬萍，李會(huì)，徐浩，陳飛，徐虹

1(成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都，610106)2(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京，210009)

溶氧調(diào)控策略對(duì)Alcaligenes sp.NX-3產(chǎn)威蘭膠發(fā)酵過程的影響*

萬萍1，李會(huì)2，徐浩2，陳飛2，徐虹2

1(成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都，610106)2(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京，210009)

主要研究了發(fā)酵過程中溶氧調(diào)控策略對(duì)Alcaligenes sp.NX－3產(chǎn)威蘭膠的影響。在7.5 L發(fā)酵罐中，首先考察了不同通氣量對(duì)菌體生長(zhǎng)、威蘭膠濃度、葡萄糖消耗、威蘭膠黏度等的影響。結(jié)果表明，通氣量為1 vvm時(shí)，有利于威蘭膠濃度的提高。通過研究不同供氧水平對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)較高的溶氧水平有利于威蘭膠的合成，但是不利于威蘭膠黏度的提高。因此提出了低供氧－中供氧－高供氧、高供氧－中供氧－低供氧2種不同溶氧調(diào)控策略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:采用高供氧－中供氧－低供氧策略，能夠使威蘭膠濃度達(dá)到25.4 g/L，葡萄糖對(duì)威蘭膠的轉(zhuǎn)化率提高到0.51 g/g，威蘭膠黏度達(dá)到2.700 Pa·s。

威蘭膠，Alcaligenes sp.NX－3，溶氧調(diào)控策略

威蘭膠(welan gum)是一種分子量高達(dá)數(shù)百萬的原核生物雜多糖［1］，它的主鏈結(jié)構(gòu)骨架由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重復(fù)單元組成，側(cè)鏈由單一的L-鼠李糖或L-甘露糖構(gòu)成［2］。威蘭膠具有稠化、懸浮、熱穩(wěn)定、絮凝和耐酸堿等性能，在石油、混凝土、食品、油墨、醫(yī)藥等行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景［3－6］。

威蘭膠可由產(chǎn)堿桿菌好氧發(fā)酵生產(chǎn)，屬于高黏度發(fā)酵類型。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，威蘭膠的積累，發(fā)酵液粘度迅速增大，高達(dá)幾千甚至上萬厘泊，嚴(yán)重影響發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)、溶氧的傳遞和吸收利用，抑制菌體生長(zhǎng)代謝，嚴(yán)重阻礙產(chǎn)物的累積。溶氧一直以來都是高粘度發(fā)酵體系中一個(gè)重要的研究因素，溶氧對(duì)好氧發(fā)酵的影響主要分為兩方面:一是溶氧濃度影響與呼吸鏈有關(guān)的能量代謝，影響微生物生長(zhǎng)代謝;二是氧直接參與產(chǎn)物合成［7］。雖然國內(nèi)外對(duì)威蘭膠生產(chǎn)工藝有著諸多的研究［8－10］，但溶氧對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響鮮有報(bào)道，而同是微生物多糖的黃原膠在這方面卻被深入研究。林劍［11］等研究了攪拌與溶氧對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)溶氧濃度對(duì)黃原膠產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)速率、黃原膠的生成率以及其質(zhì)量都有明顯的影響?；ōZ薇［12］在6 L的生物反應(yīng)器上研究了溶氧對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。結(jié)果表明發(fā)酵液中的溶氧濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)速率影響不大，但對(duì)發(fā)酵過程穩(wěn)定期的長(zhǎng)短有顯著影響;溶氧越高，黃原膠持續(xù)合成的時(shí)間越長(zhǎng)。Fernado等［13］研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中的溶氧水平對(duì)黃原膠平均分子質(zhì)量的大小有著重要影響。黃原膠的分子量隨發(fā)酵液中的溶解氧的濃度增加而增大。黃原膠同威蘭膠一樣都屬于微生物胞外多糖，它由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸聚合而成，分子量達(dá)到百萬［14］。發(fā)酵過程中隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，發(fā)酵液變黏稠，發(fā)酵體系都為高黏發(fā)酵，因此借鑒黃原膠此方面的研究將為開展溶氧水平對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響研究提供很好的借鑒意義。

1 材料和方法

1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)室自主篩選的產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp.NX－3，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為 CGMCC2428［9］。經(jīng)分析鑒定，多糖產(chǎn)物為威蘭膠［15］。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20，酵母膏 1，K2HPO42，MgSO40.1，pH 值 7.2～7.4，121 ℃ 滅菌15 min。

培養(yǎng)方法:挑取接種活化后的斜面菌苔2環(huán)于種子培養(yǎng)基中，裝液量200 mL/1 000 mL，30℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)16 h。

1.2.2 發(fā)酵液培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

從西王的創(chuàng)業(yè)路徑可以看出，這是一家在傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)色彩頗為濃厚的企業(yè)。像大多數(shù)的魯企一樣，他們?cè)诓恢挥X中成為行業(yè)巨頭，他們將更多的精力放在深耕產(chǎn)業(yè)鏈條上，很少輕易涉足陌生行業(yè)。他們更愿低調(diào)潛行，不像互聯(lián)網(wǎng)英雄那樣擁有極高的曝光度，其產(chǎn)品的知名度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于創(chuàng)始人的知名度。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 50，蛋白胨 4，K2HPO43，MgSO40.1，pH 值 7.2～7.4，121 ℃ 滅菌15 min。

7.5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)(BioFlo110，美國NBS公司):溫度30℃，裝液量4.5 L，接種量5%。當(dāng)研究不同通氣量的影響時(shí)，將攪拌轉(zhuǎn)速固定在600 r/min，通氣量分別控制在:0.5 vvm、1.0 vvm、1.5 vvm。當(dāng)研究不同攪拌轉(zhuǎn)速的影響時(shí)，將通氣控制在最佳，轉(zhuǎn)速分別控制為400、600、800 r/min。發(fā)酵過程中流加3 mmol/L的NaOH，將pH值控制在7.0。

1.2.3 不同供氧的控制

在7.5 L發(fā)酵罐中，將通氣控制在最佳，調(diào)控?cái)嚢柁D(zhuǎn)速400、600、800 r/min，分別定義為低供氧、中供氧和高供氧。

1.3 分析方法

1.3.1 葡萄糖含量的測(cè)定

生物傳感分析儀(SBA－40C，山東省科學(xué)院生物研究所)。

1.3.2 威蘭膠含量測(cè)定

威蘭膠含量測(cè)定:稱取適量體積的發(fā)酵液，蒸餾水稀釋，12 000 r/min離心30 min，去除菌體細(xì)胞沉淀。上清液加入1/5體積的V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1混合液，12 00 r/min 離心30 min，去除蛋白質(zhì)，反復(fù)去除2次。上清液用乙醇沉淀威蘭膠，60℃烘干，稱重［16］。

1.3.3 菌體干重的測(cè)定

取5 mL發(fā)酵液并適當(dāng)稀釋，于已預(yù)先稱重的干燥離心管中，8 000 r/min離心20 min，棄上清，用去離子水洗滌2次，105℃烘箱內(nèi)烘至恒重，稱量即可。

1.3.4 威蘭膠粘度的測(cè)定

威蘭膠1% 水溶液，NDJ－1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)，4號(hào)轉(zhuǎn)子，60 r/min，25℃測(cè)得。

1.3.5 相對(duì)溶氧水平(D℃)(%)的測(cè)定

由溶氧探頭在線測(cè)定。

以上實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，誤差范圍在±4%之間。

2 結(jié)果與討論

2.1 7.5 L發(fā)酵罐中，不同通氣量對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響

圖1 不同通氣量對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響

在7.5 L發(fā)酵罐中，根據(jù)威蘭膠發(fā)酵的實(shí)際情 況，選取了一個(gè)比較適中的轉(zhuǎn)速600 r/min，分別研究了0.5 vvm、1.0 vvm、1.5 vvm不同通氣量對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響。由圖1可以看出，當(dāng)通氣量為0.5 vvm時(shí)，發(fā)酵液中的溶氧水平較低，一直持續(xù)在5%左右，相應(yīng)的菌體干重，威蘭膠濃度和黏度都較低。隨著通氣量的增加，發(fā)酵液中的溶氧水平也有明顯的增加，當(dāng)通氣量為1 vvm時(shí)，溶氧水平明顯提高到10% 以上，菌體生長(zhǎng)最快，威蘭膠的濃度也最高，達(dá)20.6 g/L;葡萄糖的消耗量較通氣量0.5 vvm、1.5 vvm高，葡萄糖對(duì)威蘭膠的轉(zhuǎn)化率提高到0.41 g/g，威蘭膠黏度達(dá)到2.540 Pa·s(表1)。但當(dāng)通氣量增加到1.5 vvm時(shí)，溶氧水平繼續(xù)增高，但菌體干重、威蘭膠濃度和黏度都略有所降低，可能是過高的通氣量對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利影響。綜上所述，在發(fā)酵過程中溶氧水平對(duì)威蘭膠的發(fā)酵有較明顯的影響，該過程對(duì)氧氣的要求是適中的，過低或過高的通氣量都會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生消極的影響。

表1 不同通氣量下的葡萄糖轉(zhuǎn)化率、威蘭膠黏度比較

2.2 5 L發(fā)酵罐中，不同供氧水平對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響

在7.5 L發(fā)酵罐中，選定最優(yōu)通氣量1 vvm，分別研究了攪拌轉(zhuǎn)速為400、600、800 r/min 3種供氧水平對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，菌體生長(zhǎng)明顯受到低溶氧水平的影響，生物量較低，威蘭膠的合成速率也較慢，濃度為 17.5 g/L，威蘭膠黏度僅有1.510 Pa·s(表2)。隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高(600 r/min)，發(fā)酵過程中的溶氧水平明顯提高，菌體生長(zhǎng)速率增大，威蘭膠的濃度提高到20.6 g/L，威蘭膠黏度也明顯增大到2.540 Pa·s。其可能的原因是:攪拌轉(zhuǎn)速高時(shí)，發(fā)酵液傳質(zhì)、溶氧及氧傳遞性能得到改善，有利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。進(jìn)一步提高攪拌轉(zhuǎn)速到800 r/min，威蘭膠濃度繼續(xù)增加到22.8 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步提高到0.46 g/g，但發(fā)酵中后期的菌體濃度有所降低，威蘭膠黏度較600 r/min低，降到了2.100 Pa·s?？赡苁沁^高的攪拌轉(zhuǎn)速產(chǎn)生了過高的剪切力，對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生了損傷;并且可能把威蘭膠延伸鏈打斷，使分子量降低，從而導(dǎo)致發(fā)酵液黏度降低。

圖2 不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響

表2 不同攪拌轉(zhuǎn)速條件下葡萄糖轉(zhuǎn)化率、威蘭膠黏度情況

2.3 7.5 L發(fā)酵罐中，不同溶氧調(diào)控策略對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響

基于以上實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，在威蘭膠發(fā)酵過程中溶氧水平對(duì)威蘭膠的合成有著十分重要的影響，在發(fā)酵前期(0～24 h)，較高的供氧(800 r/min)有利于菌體的生長(zhǎng)和威蘭膠的合成。而在發(fā)酵中期(24～48 h)，供氧(600 r/min)有利于高黏發(fā)酵液的形成。在發(fā)酵后期(48～72 h)，由于發(fā)酵液變的更加黏稠，低的轉(zhuǎn)速能夠防止高轉(zhuǎn)速對(duì)威蘭膠分子鏈的破壞。因此為了同時(shí)提高威蘭膠的濃度和黏度，比較了2種不同的溶氧調(diào)控策略對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響。策略1(前24 h低供氧，24～48 h采用中供氧，48 h至發(fā)酵結(jié)束采用高供氧);策略2(前24 h高供氧，24～48 h采用中供氧，48 h至發(fā)酵結(jié)束采用低供氧)。

結(jié)果表明，策略1隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，菌體濃度增大，溶氧水平急劇下降。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為12 h時(shí)，溶氧的水平降到最低2.9%，之后溶氧水平一直在5%以下，雖然24 h和48 h提高轉(zhuǎn)速來提高發(fā)酵液中的溶氧水平，但菌體的生長(zhǎng)速率還是受到明顯影響，威蘭膠濃度為22 g/L，黏度為2.300 Pa·s(表3)。采用溶氧策略2后，菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(6～48 h)溶氧水平較策略1有明顯的提高，整個(gè)發(fā)酵過程的溶氧水平一直持續(xù)在10%以上，菌體成長(zhǎng)速率明顯提高，威蘭膠的濃度提高到25.4 g/L，葡萄糖殘留量為5.5 g/L(圖3b)，葡萄糖對(duì)威蘭膠的轉(zhuǎn)化率提高到0.51 g/g，威蘭膠黏度明顯提高為2.700 Pa·s(表3)。該結(jié)果較之前的分批發(fā)酵研究水平有所提高［16－17］。

表3 不同溶氧策略下葡萄糖轉(zhuǎn)化率、威蘭膠黏度情況

分析可能原因是:先高溶氧，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了充足的氧氣，這時(shí)菌體能量供應(yīng)充足，菌體生長(zhǎng)較快且代謝旺盛，細(xì)胞內(nèi)各種初級(jí)代謝物質(zhì)和次級(jí)代謝產(chǎn)物得以充分累積，有利于威蘭膠的合成;后期主要以威蘭膠的累積為主，對(duì)氧氣的需求量減少，在不影響威蘭膠累積的基礎(chǔ)上，后期降低攪拌速度，避免了威蘭膠延伸鏈被過高的攪拌速率產(chǎn)生的過大剪切力打斷，有利于威蘭膠分子量的提高，提高產(chǎn)品的黏度。

◆菌體干重;●葡萄糖濃度;▲威蘭膠濃度;○溶氧水平圖3 不同溶氧策略對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響

分析以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期(6～24 h)的溶氧水平對(duì)威蘭膠的發(fā)酵有著重要的影響。此時(shí)期菌體大量增長(zhǎng)，菌體代謝比較旺盛，對(duì)溶氧的需求急劇增加，致使發(fā)酵液中溶氧水平迅速降低;但是如果此時(shí)溶氧水平過低，會(huì)嚴(yán)重限制菌體的增殖，并造成不可逆的不利影響?？赡苁沁^低的溶氧嚴(yán)重影響了菌體的能量代謝和正常生理代謝，進(jìn)一步影響了威蘭膠合成途徑中部分關(guān)鍵酶的合成，從而對(duì)威蘭膠的累積造成了不可逆的影響。

3 結(jié)論

(1)通氣量1 vvm有利于威蘭膠濃度的提高，過低或過高的通氣量都會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生消極影響。

(2)提高攪拌轉(zhuǎn)速可以提高威蘭膠的濃度，攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min時(shí)，威蘭膠濃度達(dá)到22.8 g/L，但是此時(shí)的威蘭膠黏度較 600 r/min時(shí)低，僅為2.100 Pa·s。

(3)在Alcaligenes sp.NX－3發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠中，溶氧水平對(duì)其有著重要的影響，尤其是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期尤為重要;采用高供氧－中供氧－低供氧調(diào)控方法，使威蘭膠的濃度和黏度都有了明顯的提高:濃度提高到25.4 g/L，葡萄糖對(duì)威蘭膠的轉(zhuǎn)化率提高到0.51 g/g，威蘭膠黏度提高到2.700 Pa·s。

溶氧對(duì)威蘭膠合成的影響的深層機(jī)理還不清楚，但該研究為下一步借助于代謝工程和酶工程的方法，深入研究溶氧水平對(duì)威蘭膠合成代謝途徑及威蘭膠分子量的影響奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of Dissolved Oxygen Control Strategies on Welan Gum Fermentation by Alcaligenes sp.NX－3

Wan Ping1，Li Hui2，Xu Hao2，Chen Fei2，Xu Hong2
1(Faculty of Biotechnology Industry，Chengdu University，Chengdu 610106，China)2(State Key Laboratory of Materials-oriented Chemical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China)

The dissolved oxygen control in the production of welan gum by Alcaligenes sp.NX－3 was investigated.Firstly，based on the analysis of the effect of various aeration rate on cell growth，welan gum concentration，glucose consumption，dissolved oxygen level，and welan gum viscosity，we confirmed that in a 7.5 L bioreactor 1 vvm aeration rate was beneficial for welan gum production.After that，the effect of different oxygen supply levels on the welan gum fermentation was studied.The results indicated that high oxygen supply level could improve the welan gum production，but it was not helpful for welan gum viscosity.Therefore，the two oxygen supply strategies:low-moderatehigh oxygen supply level and high-moderate-low oxygen supply level were proposed.The results showed that the latter was better for the welan gum fermentation.Finally，the maximum concentration of welan gum reached 25.4 g/L with a yield of 0.51 g/g and the welan gum viscosity of 2.700 Pa·s .

welan gum，Alcaligenes sp.NX －3，dissolved oxygen control strategy

副教授(徐虹教授為通訊作者)。

*江蘇省普通高校研究生科技創(chuàng)新計(jì)劃(CX10B_183Z);江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金(CX(10)226);國家科技支撐項(xiàng)目“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域(2011BAD23B00)。

2010－07－07，改回日期:2011－03－01