南極磷蝦蛋白酶分離純化及部分性質(zhì)研究*

杭虞杰，李學(xué)英，楊憲時(shí)，遲海，郭全友

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)2(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)

南極磷蝦蛋白酶分離純化及部分性質(zhì)研究*

杭虞杰1，2，李學(xué)英1，楊憲時(shí)1，遲海1，郭全友1

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)2(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)

對(duì)在南極磷蝦自溶過程中起主要作用的蛋白酶的分離純化條件和主要生化性質(zhì)進(jìn)行了研究。經(jīng)過30% ～70%硫酸銨分級(jí)沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，Sephacryl S-200 HR凝膠層析后得到電泳純的蛋白酶，該酶純化倍數(shù)為12.59，產(chǎn)率為43%，分子質(zhì)量約為28 ku;最適pH和最適溫度為pH 8.0和50℃;該酶pH穩(wěn)定范圍為pH 7.0～9.5，并在45℃以下較穩(wěn)定;苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)、對(duì)甲苯磺?；嚢彼崧燃谆?TLCK)對(duì)該酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。

南極磷蝦，蛋白酶，分離純化，性質(zhì)

南極磷蝦是南極海域資源量最大的單物種生物之一，其巨大的生物量和潛在的漁業(yè)資源日益受到人們的關(guān)注［1－3］，開發(fā)利用南極磷蝦資源具有重大意義。南極磷蝦體內(nèi)蛋白酶活力很強(qiáng)［4－6］，死后自溶很快，甚至在－18℃以下也有較強(qiáng)的自溶能力［7］。Konagaya等［6］研究認(rèn)為，蛋白酶可能對(duì)南極磷蝦品質(zhì)變化起主要作用。Osnes等［8］研究發(fā)現(xiàn)，類胰蛋白酶對(duì)南極磷蝦自溶起到40%的作用。本研究對(duì)南極磷蝦蛋白酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)其部分性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 原料

南極磷蝦由我國(guó)“南極海洋生物資源開發(fā)利用項(xiàng)目組”于2010年1月在南極FAO 48.1區(qū)捕撈，船上凍結(jié)后－23℃凍藏，－18℃條件下于2010年4月運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后，在－28℃貯藏備用。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

主要試劑:偶氮酪蛋白(Azocasein)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，對(duì)甲苯磺酰基賴氨酸氯甲基酮(TLCK)，對(duì)甲苯磺?；奖滨Ｂ燃谆?TPCK)均購(gòu)自美國(guó)sigma公司;DEAE Sepharose Fast Flow，Sephacryl S-200 HR樹脂購(gòu)自美國(guó)Amersham Biosciences公司;大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)，上海研生生化試劑有限公司，其余化學(xué)試劑皆為國(guó)產(chǎn)化學(xué)分析純。

主要儀器:5810R高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf，德國(guó);LGJO-5冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科技儀器廠;BS-100A自動(dòng)部分收集器、BT01－100蠕動(dòng)泵，上海精科實(shí)業(yè)有限公司;Power wave XS酶標(biāo)儀，Biotek，美國(guó);DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司;電熱恒溫水浴鍋DK-S24，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;pHS-2C型酸度計(jì)，上海偉業(yè)儀器廠;FA1004A電子天平，上海精天電子儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗酶液的制備

將新鮮的南極磷蝦，按1∶2(g∶mL)比例加入事先預(yù)冷到0℃的0.05 mol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液中，于高速組織搗碎機(jī)搗碎，4℃靜置4 h后，12 000 r/min離心30 min，取上清液，即為粗酶。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的(NH4)2SO4，4℃下靜置4 h，12 000 r/min離心15 min，取上清液后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的(NH4)2SO4，4 ℃條件下靜置4 h，12 000 r/min離心15 min，收集沉淀，按 1∶2(g∶mL)加入 0.05 mol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液，透析24 h后將溶液置于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 陰離子交換柱DEAE-Sepharose Fast Flow分離純化

取透析后的樣品5 mL經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(2.5 cm×17 cm)進(jìn)行分離純化，以0.05 mol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液洗去未掛柱的雜蛋白組分，再分別用含0.5、0.6、1 mol/L NaCl的緩沖液作階段式洗脫，控制流速為1.5 mL/min，5 mL/管收集，于280nm下檢測(cè)，繪制洗脫曲線并檢測(cè)蛋白酶活性，計(jì)算總蛋白質(zhì)、比活力、產(chǎn)率和純化倍數(shù)，收集活性峰，透析后用PEG20000濃縮，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 DEAE-Sephacryl S-200HR分離純化

取濃縮后的樣品2 mL經(jīng)Sephacryl S-200 HR凝膠過濾柱(1.6 cm×60 cm)進(jìn)行分離純化，用含有0.15 mol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫，流速為0.4 mL/min，4 mL/管收集，280nm下檢測(cè)，繪制洗脫曲線并檢測(cè)蛋白酶活性，計(jì)算總蛋白質(zhì)、比活力、產(chǎn)率和純化倍數(shù)，收集活性峰，透析后凍干，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 酶活力測(cè)定

［9］方法，以1%酪蛋白溶液為底物，0.5 mL酶液中加入等體積0.05 mol/L pH 7.5 Tris-HCl，于37℃恒溫水浴5 min，加入1 mL 1%酪蛋白溶液反應(yīng)20 min后，加入1 mL 15%TCA終止反應(yīng)，12000 r/min離心15 min，上清液于280 nm下測(cè)定吸光度;以先加入1 mL 15%TCA后加入0.5 mL粗酶液為空白樣。該條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.5 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

參考文獻(xiàn)［10］方法，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酶液中的可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 蛋白酶分子量測(cè)定

根據(jù) LaemmLi［11］的方法，進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。其中分離膠濃度為12%，電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。

1.3.7 南極磷蝦蛋白酶最適pH測(cè)定

以1%酪蛋白為底物，37℃時(shí)，將酶液分別置于不同pH條件下(pH 5.0～11.0)，測(cè)定酶活力以確定最適pH。酶活力測(cè)定方法同1.3.4。其中不同的緩沖液分別為Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 5.0～6.6)，Tris-HCl緩沖液(pH 7.0 ～ 9.0)，甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.2～11)。

1.3.8 南極磷蝦蛋白酶最適溫度測(cè)定

pH 7.5時(shí)，以1%酪蛋白為底物，將酶液置于不同溫度條件下(20、30、40、50、60、70℃)測(cè)定酶活力以確定最適溫度。酶活力測(cè)定方法同1.3.4。

1.3.9 南極磷蝦蛋白酶熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性

37℃時(shí)，以1%酪蛋白為底物，將酶液置于不同pH環(huán)境中處理30 min后，測(cè)定酶液殘余活力，以確定南極磷蝦蛋白酶pH穩(wěn)定性;酶液分別于35、45和50℃熱環(huán)境中處理不同時(shí)間后，在最適條件下測(cè)定殘余酶活力，以確定南極磷蝦蛋白酶熱穩(wěn)定性。

1.3.10 抑制劑對(duì)酶活力的影響

選取 PMSF、EDTA、SBTI、TPCK 和 TLCK，配制濃度均為10 mmol/L。酶液與抑制劑等體積混合后，于37℃下恒溫水浴30 min，pH 8.0下測(cè)定殘留酶活，酶活力測(cè)定方法同1.3.4。抑制率計(jì)算:

2 結(jié)果與討論

2.1 南極磷蝦蛋白酶的分離純化

南極磷蝦經(jīng)過Tris-HCl抽提、硫酸銨分級(jí)沉淀，所得的粗酶液經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析洗脫后出現(xiàn)了3個(gè)蛋白峰(圖1)，經(jīng)過酶活性檢測(cè)后，前2個(gè)蛋白峰有活力，第2個(gè)峰活性很強(qiáng)，合并活性峰，用PEG20000濃縮后上樣于Sephacryl S-200凝膠層析得到2個(gè)蛋白活性峰，只有第2個(gè)峰有較強(qiáng)的活性，合并活性峰，透析后凍干。

圖1 南極磷蝦蛋白酶DEAE-Sepharose F.F.洗脫結(jié)果

圖2 Sephacryl S-200 HR凝膠層析洗脫結(jié)果

南極磷蝦蛋白酶經(jīng)過陰離子交換層析和凝膠過濾層析后純化的活性組分與粗酶液相比有較明顯的提高純化倍數(shù)為12.59，產(chǎn)率為43%(見表1)。這較已報(bào)道的蛋白酶的產(chǎn)率的效果更好，但是分離純化倍數(shù)較低［12－13］，估計(jì)是分離純化過程中沒有達(dá)到優(yōu)化，造成蛋白酶損失或純化較少。

2.2 南極磷蝦蛋白酶分子質(zhì)量

粗酶液經(jīng)過分離純化，用SDS-PAGE電泳測(cè)定其分子質(zhì)量，結(jié)果見圖3。如圖3所示，南極磷蝦蛋白酶顯示為單一條帶，分子質(zhì)量大約為28 ku，Kimoto［14］等對(duì)南極磷蝦腹部肌肉部分的蛋白酶進(jìn)行分離純化，結(jié)果顯示，其分子質(zhì)量大約為30 ku，這與本試 驗(yàn)的結(jié)果相近。

表1 南極磷蝦蛋白酶純化

圖3 南極磷蝦蛋白酶SDS-PAGE電泳

2.3 南極磷蝦蛋白酶部分生化性質(zhì)分析

2.3.1 南極磷蝦蛋白酶最適pH及pH穩(wěn)定性

南極磷蝦蛋白酶最適pH和pH穩(wěn)定性曲線見圖4。由圖4可知，pH 5.0～8.0時(shí)，酶反應(yīng)速率逐漸升高，pH 8.0處達(dá)到最高;pH＞8.0時(shí)，酶反應(yīng)速率開始逐步下降。該酶在pH 7.0～9.5之間比較穩(wěn)定，剩余酶活力在80%以上，說明南極磷蝦蛋白酶在堿性環(huán)境中比較穩(wěn)定。南極磷蝦蛋白酶在pH 6.5～9.5之間活性較高，這與南美白對(duì)蝦蛋白酶［15］和大西洋白對(duì)蝦蛋白酶［16］相近。

圖4 南極磷蝦蛋白酶的最適pH曲線及pH穩(wěn)定性曲線

2.3.2 南極磷蝦蛋白酶最適溫度

南極磷蝦蛋白酶最適溫度曲線見圖5。由圖5可知，該酶在40～55℃活性較高，并在50℃時(shí)活性最高，這與吳志強(qiáng)［17］對(duì)太平洋磷蝦和 Ahsan［18］等對(duì)鳀魚蛋白酶最適溫度研究結(jié)果相似。超過50℃后，酶反應(yīng)速率逐步降低。由此結(jié)果可知，南極磷蝦蛋白酶反應(yīng)最適溫度為50～55℃。

圖5 南極磷蝦蛋白酶最適溫度曲線

2.3.3 南極磷蝦蛋白酶熱穩(wěn)定性測(cè)定

南極磷蝦蛋白酶的熱穩(wěn)定性研究結(jié)果見圖6。由圖6可知，酶在4℃下保存60 min，殘留酶活保持在90%以上，這與南極磷蝦棲息的環(huán)境相適應(yīng)。45℃熱處理60 min后，酶活仍然保持在60%以上，表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性;50℃時(shí)，酶活隨時(shí)間的延長(zhǎng)迅速降低，熱處理60 min后，酶活損失86%以上。

圖6 南極磷蝦蛋白酶熱穩(wěn)定性曲線

2.3.4 抑制劑對(duì)南極磷蝦蛋白酶活力的影響

不同抑制劑對(duì)南極磷蝦蛋白酶活力的影響結(jié)果見表2。由表2可知，PMSF對(duì)該酶活性有很強(qiáng)的抑制作用，說明該酶活性中心具有絲氨酸殘基，是一種絲氨酸蛋白酶;TLCK和SBTI對(duì)該酶也有很強(qiáng)的抑制作用，而TPCK對(duì)該酶基本沒有影響，說明該酶具有胰蛋白酶特性但沒有胰凝乳蛋白酶的特性。同時(shí)金屬蛋白酶抑制劑EDTA對(duì)酶活力無影響，說明該酶催化底物時(shí)不需要金屬離子的參與，南極磷蝦蛋白酶可能不屬于金屬蛋白酶。

表2 不同抑制劑對(duì)南極磷蝦蛋白酶活力的影響

3 結(jié)論

(1)粗酶液經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀，DEAE-Sepharose F.F.陰離子交換柱，Sephacryl S-200 HR凝膠層析后得到電泳純級(jí)南極磷蝦蛋白酶，該酶比活力為13.63U/mg，純化倍數(shù)為12.59，產(chǎn)率為43%;該酶的分子質(zhì)量約為28 ku。

(2)南極磷蝦蛋白酶的最適pH和最適溫度分別為8.0℃和50℃;并且有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。

(3)南極磷蝦蛋白酶是種絲氨酸蛋白酶并具有胰蛋白酶的特性。PMSF，TLCK，SBTI對(duì)南極磷蝦蛋白酶有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率分別為86%、93%和95%;TPCK，EDTA對(duì)該酶基本沒有影響。

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Partial Purification and Characterization of Protease from Antarctic krill(Euphausia Superba)

Hang Yu-jie1，2，Li Xue-ying1，Yang Xian-shi1，Chi Hai1，Guo Quan-you1
1(East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China)2(School of Medical Instrument and Food Engineering，university of shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China)

A protease that plays a role on autolysis of Antarctic krill was purified from Antarctic krill and its major physical and chemical characteristics were studied.The purified protease was obtained after 30% ～70%ammonium sulfate grading precipitation，DEAE-Sepharose Fast Flow anion-exchange chromatography and Sephacryl S－200 HR chromatography.The protease was confirmed by a single band on SDS-PAGE and was purified by 12.59-fold with the yield of 43%.The relative molecular mass of the enzyme was determined to be about 28 ku.The casein was used as substrate to measure the characteristics of the protease.The optimum pH and temperature of the enzyme were 8.0 and 50 ℃，respectively.The enzyme was stable when pH value is in the range of 7.0 to 9.5 and the temperature is blow 45 ℃;PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride)，SBTI(strontium bismuth titanate)and TLCK(N-α-Tosyl-L-Lysine Chloromethyl Ketone)can obviously inhibit the enzyme.

Antarctic krill，protease，purification，characterization