納豆芽孢桿菌蛋白酶的制備及性質研究*

潘進權，鄧社興，梁亞眉

(湛江師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江，524048)

納豆芽孢桿菌蛋白酶的制備及性質研究*

潘進權，鄧社興，梁亞眉

(湛江師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江，524048)

納豆芽孢桿菌是納豆發(fā)酵生產的主要菌種，對其胞外蛋白酶催化特性的研究有助于了解納豆的發(fā)酵生產過程，并有利于從中發(fā)掘有開發(fā)應用潛力的蛋白酶。實驗從不同納豆產品中分離篩選得到1株高產蛋白酶的納豆芽孢桿菌，對其胞外蛋白酶的催化特性及活性影響因子進行了分析。結果顯示，納豆芽孢桿菌蛋白酶是一典型的金屬蛋白酶，EDTA幾乎可完全抑制其活性，Ca2+是其活性中心的輔基;該蛋白酶在60℃、pH 7.0有最大催化活性，在pH 6～9和低于45℃條件下具有很好的穩(wěn)定性;50℃時，該蛋白酶會緩慢失活，其熱失活規(guī)律符合一級指數衰減模型:a=0.124+0.887e(－0.45t);該蛋白酶對大豆蛋白有很強的水解能力，其水解效率與Alcalase蛋白酶相當，可以實現底物蛋白的深度水解，具有一定的開發(fā)應用價值。

納豆芽孢桿菌，蛋白酶，制備，性質

納豆是傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，具有很好的保健及食療價值，這主要與該產品中納豆芽孢桿菌的益生作用、大豆異黃酮、活性多肽及納豆激酶等有密切的關系［1－2］。在納豆的發(fā)酵生產中納豆芽孢桿菌可以分泌多種胞外酶，包括淀粉酶、脂肪酶、納豆激酶及蛋白酶等［3］。這些酶的共同作用賦予了納豆產品特有的風味，以及產品的保健價值。因此對這些酶的研究將有助于了解納豆的發(fā)酵工藝過程，對發(fā)酵生產給予理論指導，同時也可從中發(fā)掘一些有應用價值的新酶。雖然納豆的發(fā)酵生產有悠久的歷史，但是對該菌種胞外酶系的研究卻相對較少，主要的研究工作集中于該菌種益生作用的探討［4］，納豆激酶［7－9］的研究與開發(fā)等。然而，對該菌種胞外蛋白酶的研究卻相對較少，僅有少數學者對該菌種的發(fā)酵產酶特性進行過探討［5－6］，而對于其胞外蛋白酶的組分構成及其催化特性卻鮮見報道。為了探討納豆芽孢桿菌胞外蛋白酶在納豆發(fā)酵生產中的作用，課題組對納豆芽孢桿菌胞外蛋白酶的催化特性進行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種及試劑

納豆芽孢桿菌(Bacillus natto sp.)，實驗室分離保藏菌種;苯甲基磺酰氟 PMSF、EDTA、E －64、Pepstatin，Amersco公司;大豆分離蛋白(蛋白含量90%)，萊州福客生物技術有限公司;木瓜蛋白酶，Merck公司;Alcalase堿性蛋白酶及protamex復合蛋白酶，Novo Nordisk公司;實驗中所用其他試劑均為分析純。

1.1.2 斜面活化培養(yǎng)基

5 g/L葡萄糖，5 g/L牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L NaCl，15 g/L 瓊脂，pH 7.0。

1.1.3 液體種子培養(yǎng)基

葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏 5 g/L，NaCl 5 g/L，Tween 80 1 mL/L，pH 7.0。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

可溶性淀粉 35.8 g/L，黃豆粉 24.9 g/L，麩皮 20 g/L，K2HPO42.34 g/L，CaCl22 g/L，Tween 80 2 g/L，pH 8.0～8.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子活化

菌株經試管斜面活化后，接種1環(huán)于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37℃，200r/min的搖床上培養(yǎng)24h。

1.2.2 液態(tài)發(fā)酵

每個250 mL三角瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接種2 mL活化的液體種子，置于全溫搖床中于37℃，發(fā)酵70h。

1.2.3 蛋白酶的制備

液態(tài)發(fā)酵結束后，將發(fā)酵液10 000 r/min、4℃冷凍離心20 min，取上清液用截留分子量30 000 u的超濾膜包進行超濾濃縮并除去發(fā)酵液中的小分子物質，所得濃縮液即為粗酶液。

1.2.4 蛋白酶活性的測定

采用 Folin酚法［10］:1.5 mL離心管中加入0.3 mL適當稀釋的酶液及0.3 mL 1.5%酪蛋白(溶于0.05 mol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖液)，40℃反應10 min，加0.6 mL 0.4 moL/L的三氯乙酸終止反應，靜置15 min后14 000×g離心10 min，取上清液0.6 mL，加入3 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液及0.6 mL福林酚試劑，于40℃顯色20 min，于680 nm測定其吸光值，根據標準曲線計算酶活單位。

酶活定義:實驗條件下，每分鐘水解酪蛋白生成1 μg當量酪氨酸所需酶量為1個活力單位。

1.2.5 納豆桿菌蛋白酶的催化性質

1.2.5.1 pH值對蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響

按照酶活測定方法于不同pH(pH3.0～11.0)緩沖條件下測定蛋白酶的活性，考察pH對納豆桿菌蛋白酶活性的影響。根據實驗結果繪制pH－活力曲線，并由此確定蛋白酶的最適作用pH范圍。

用不同pH的緩沖液分別調節(jié)酶液的pH到pH 3.0～11.0，于室溫(25℃)放置約1h，測定放置前后酶活，計算酶活殘留率。以酶活殘留率對pH值作圖，繪制蛋白酶的pH穩(wěn)定曲線。

1.2.5.2 溫度對蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響

按照酶活測定方法分別于不同的溫度(30～70℃)下測定納豆桿菌蛋白酶的活性，考察溫度對蛋白酶活性的影響。根據實驗結果繪制溫度－活力曲線，并由此確定酶的最適作用溫度。

在酶的穩(wěn)定pH條件下，將酶液分別于不同溫度(30～70℃)下保溫30 min，測定保溫前后蛋白酶活性的變化，考察溫度對蛋白酶穩(wěn)定性的影響。以酶活殘留率對溫度作圖，繪制蛋白酶的熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.5.3 抑制劑對蛋白酶活性的影響

在酶的穩(wěn)定pH條件下，將酶液與不同類型的抑制劑混和，然后在室溫中放置約30 min，測定加入抑制劑保溫后蛋白酶的活性?？疾煲种苿Φ鞍酌富钚缘挠绊憽?/p>

1.2.5.4 金屬離子對蛋白酶活性的影響

在酶的穩(wěn)定pH條件下，將酶液與不同的金屬離子溶液混和，于室溫中放置30 min后測定酶活，比較各種金屬離子對蛋白酶活性的影響。

1.2.5.5 活性中心金屬離子的確定

(1)脫輔基酶蛋白的制備［11］:在原酶液中加入終濃度10 mmol/L EDTA，置于截留分子質量為8 000 u的透析袋中，在0.02 mol/L pH7.5 Tris－HCl緩沖液(含10 mmol/L EDTA)中4℃透析12 h。然后用0.02 mol/L pH7.5 Tris－HCl緩沖液(不含任何金屬離子)于4℃透析24 h，期間要多次更新緩沖液。由此即可得到脫金屬離子輔基酶蛋白溶液。

(2)金屬離子類型的確定:在脫輔基酶蛋白溶液中加入終濃度為1 mmol/L的不同金屬離子，放置30 min后測定加入金屬離子前后酶液活性的變化。

1.2.5.6 熱失活動力學

將適當稀釋的酶液置于50℃的水浴中保溫，每間隔一定時間取樣測定蛋白酶的活性，觀察保溫過程中蛋白酶活性的變化。定義初始的蛋白酶相對活力為1，對所得實驗數據進行非線性模型擬合。

1.2.6 納豆桿菌蛋白酶對大豆蛋白的水解

用蒸餾水配制濃度5g/100 mL的大豆蛋白，并調至pH 8.0，置于沸水浴中熱處理15 min。冷卻后按照酶與底物比2 000 u/g分別加入納豆桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶及Protamex復合蛋白酶，置于50℃下保溫酶解5h。酶解結束后調節(jié)水解液至pH 5.0并煮沸滅酶5 min，于5 000 r/min離心10 min，所得上清即為蛋白水解液。測定蛋白水解液的水解度值，比較各蛋白酶對大豆蛋白水解效率的差異。

1.2.7 蛋白水解液水解度的測定

大豆蛋白水解度值采用氨基酸態(tài)氮含量來表示，用茚三酮顯色的方法來測定［12］:取適當稀釋后的蛋白水解液0.40 mL于試管中并加入1.60 mL蒸餾水和1.00 mL茚三酮顯色劑混勻后置于沸水浴中加熱15min。冷卻后加入5.00 mL40%乙醇溶液混勻，放置l5min，同時作試劑空白。以試劑空白為參比于570nm測定樣品顯色液的吸光度值。根據標準曲線(以甘氨酸為標準物)計算蛋白水解液中氨基酸態(tài)氮的含量(mg/mL)。由此計算出樣品的水解度為:

式中:DH為樣品的水解度值，mg/100g;C為在標準曲線上查得的測試樣中氨基酸態(tài)氮的濃度，mg/mL;n為蛋白水解液的稀釋倍數;m為水解前樣品中蛋白的濃度，g/mL。

2 結果與討論

2.1 溫度對蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響

溫度對納豆桿菌蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響如圖1所示。該蛋白酶在60℃有最大催化活性，高于65℃活性會迅速下降。此外，該蛋白酶在相對較低的溫度下也有較強活性，如30℃時，該蛋白酶的活性是最大催化活性的63%。穩(wěn)定性實驗結果表明:納豆桿菌蛋白酶具有相對較好的熱穩(wěn)定性，在低于45℃時保溫30 min，該蛋白酶的活性基本上無損失，在50℃保溫30 min后，酶活殘留率依然可高達90%左右;若保溫溫度超過55℃，則該蛋白酶會迅速失活;例如，60℃保溫30 min后，該蛋白酶酶活僅有50%的殘留。

圖1 溫度對納豆桿菌蛋白酶活性及穩(wěn)定性影響

2.2 pH值對蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響

pH值對納豆桿菌蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響如圖2所示。納豆桿菌蛋白酶的pH-活性曲線相對較窄，pH對其活性的影響非常顯著。該蛋白酶在pH7.0左右有最大催化活性;而在pH5.0時，蛋白酶的活性僅為最大活性的30%左右;當pH低于4.0則基本上沒有活性。穩(wěn)定性實驗結果表明，該酶在中性及堿性(pH 6.0～9.0)的條件下有相對較好的穩(wěn)定性;在酸性(pH＜5.0)條件下非常不穩(wěn)定，會迅速失活;如在pH 4.0保溫僅30 min，酶活損失達80%。

圖2 pH對納豆桿菌蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響

2.3 抑制劑對蛋白酶活性的影響

探討了各種抑制劑及化學物質對納豆桿菌蛋白酶活性的影響，結果如表1所示。

表1 抑制劑對蛋白酶活性的影響

在選用的幾種常用蛋白酶抑制劑中，僅EDTA幾乎可以完全抑制該蛋白酶的活性，初步表明納豆桿菌分泌的蛋白酶是一類金屬蛋白酶，這與文獻報道結果有所不同［13］。另外，還原劑DTT對該蛋白酶活性也有60%的抑制作用，初步說明二硫鍵對于該金屬蛋白酶的活性有非常重要的作用。除此外，PMSF對該蛋白酶也有弱的抑制作用，說明絲氨酸殘基對于該蛋白酶活性也有一定的貢獻。實驗結果還顯示，該蛋白酶對離子型表面活性劑SDS非常敏感，0.5%的SDS幾乎可以完全抑制其活性，而非離子型表面活性劑Tween 80卻對該酶有一定的激活作用。另外，該蛋白酶對乙醇也非常敏感，濃度20%的乙醇對該蛋白酶就表現出較強抑制作用，可抑制約40%的活性。

2.4 金屬離子對蛋白酶活性的影響

考察了常見金屬離子對納豆桿菌蛋白酶活性的影響，結果如表2所示。在所試驗的幾種金屬離子中，Cu2+對該蛋白酶有非常強的抑制作用，終濃度5 mmol/L Cu2+可以抑制其66%的活性;Fe2+對該蛋白酶也顯示出一定的抑制作用，終濃度5 mmol/L時可以抑制其活性的32%左右;另外，Mn2+對該蛋白酶也有極弱的抑制作用。除此之外，其他金屬離子對該蛋白酶活性的影響不明顯。

2.5 活性中心金屬離子類型的確定

抑制劑實驗結果顯示，納豆桿菌蛋白酶是一種典型的金屬蛋白酶。為了考察其活性中心金屬離子類型，探討了各種金屬離子對脫輔基酶蛋白活性的影響，結果如表3所示。

表2 金屬離子對蛋白酶活性的影響

表3 金屬離子對脫輔基酶蛋白活性的影響

納豆桿菌蛋白酶脫除金屬離子后，其活性大幅降低，僅為起始酶活的13%左右;在試驗的幾種常見金屬離子中，Ca2+對脫輔基酶蛋白活性恢復有最顯著的作用，濃度1mmol/L Ca2+可使酶蛋白活性恢復為起始的87%左右，結果初步表明納豆桿菌蛋白酶活性中心的離子是Ca2+。實驗還發(fā)現，將納豆桿菌蛋白酶活性中心的Ca2+換成Mg2+、Zn2+或Mn2+，該蛋白酶也表現出一定的催化活性;若將Ca2+換成Fe2+、Cu2+或Co2+，該蛋白酶活性幾乎完全喪失。

2.6 熱失活動力學

為考察納豆桿菌蛋白酶在50℃的穩(wěn)定性及變性失活規(guī)律，對該酶在50℃的失活動力學進行探討。以酶活殘留率與保溫時間作圖，結果如圖3。根據酶失活理論，用Origin Pro 8.0軟件對實驗結果進行指數衰減模型擬合。結果發(fā)現，該蛋白酶在50℃的熱失活規(guī)律符合一級指數衰減動力學模型:a=0.124+0.887e(－0.45t)。其模型擬合相關系數R2=0.992。說明該模型能很好的解釋該蛋白酶組分在50℃的熱變性失活過程，具有較高的可信度。

2.7 納豆桿菌蛋白酶對大豆蛋白的水解

比較了納豆桿菌蛋白酶與其他幾種商品化蛋白酶對大豆蛋白的水解效果，結果如圖4所示。

圖3 納豆桿菌蛋白酶的熱失活曲線

圖4 不同蛋白酶對大豆蛋白的水解

在試驗的幾種蛋白酶中，納豆桿菌蛋白酶與Alcalase堿性蛋白酶均對大豆蛋白顯示出較強的水解效率，兩者的水解效果基本相當;而木瓜蛋白酶的水解效率最低。已有的研究結果表明，Alcalase堿性蛋白酶是現有商品化蛋白酶中肽鍵選擇性最為寬泛的一種蛋白酶，它往往可以實現目標蛋白的高效水解［14］。以上結果初步表明，納豆桿菌蛋白酶也具有相對較為寬泛的肽鍵選擇性，可以實現大豆蛋白的高效水解。

3 結論

與眾多豆類發(fā)酵食品相似，在納豆的發(fā)酵過程中，大豆蛋白的水解是其中一個非常重要的生化過程，它對于納豆的營養(yǎng)保健價值及風味形成有著密切的關系。因此，對參與這一生化過程的蛋白酶性質的探討將有助于發(fā)掘出新型的蛋白酶及對納豆發(fā)酵過程的全面了解，為其發(fā)酵生產提供理論依據。在前期的工作中，從大量納豆發(fā)酵產品中分離得到了一株高產蛋白酶的納豆芽孢桿菌，并對其發(fā)酵產酶的特點進行了分析，在此基礎上對該菌株蛋白酶催化特性進行了探討。實驗結果顯示:納豆桿菌分泌的蛋白酶是一類典型的中性金屬蛋白酶，EDTA幾乎可完全抑制其活性，Ca2+是其活性中心的輔基;常見金屬離子中Cu2+對其有非常強的抑制作用，Fe2+對其也有弱的抑制作用;該蛋白酶在60℃、pH 7.0有最大催化活性，在pH 6～9和低于45℃條件下具有很好的穩(wěn)定性;當溫度在50℃時，該蛋白酶會緩慢失活，其熱失活規(guī)律符合一級指數衰減模型:a=0.124+0.887e(－0.45t);水解實驗結果表明，該蛋白酶對大豆蛋白有很強的水解能力，其水解效率與Alcalase蛋白酶相當，初步表明該蛋白酶具有相當寬泛的肽鍵選擇性，可以實現底物蛋白的深度水解，具有一定的開發(fā)應用價值。

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Preparation and Characterization of Protease from Bacillus natto

Pan Jin-quan，Deng She-xing，Liang Ya-mei
(School of Life Science and Technology，Zhanjiang Normal University，Zhanjiang 524048，China)

Bacillus natto was the primary microorganism used in the production of natto ，and the study on the characterization of protease from Bacillus natto will help to conduct the production of natto and to explore new protease.One Bacillus natto of high-yield protease was isolated from natto，and catalysis characterization of protease secreted from this Bacillus natto was investigated.Results indicated:protease from Bacillus natto was a particular Metalloproteases，it could be completely inhibited by EDTA，and had Ca2+in the active center.The protease had the maximum activity at pH 7.0 and 60℃ and was stable in the pH range of 6.0 ～9.0 and below 45℃.The protease was unstable at 50℃and the kinetics of deactivation fit the model:a=0.124+0.887e(－0.45t).Protease from Bacillus natto has a very high hydrolysis efficiency to soy protein，meaning that it＇s a good application in the production of hydrolysate of food protein.

Bacillus natto，protease，preparation，characterization

博士，講師。

*廣東省自然科學基金項目(9452404801001943);湛江師范學院博士專項基金項目(ZL0912)

2011－06－09，改回日期:2011－07－12