以O(shè)RAC法為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化制備大豆抗氧化肽*

曹亞蘭，趙謀明，鄭賽晶，任嬌艷

1(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州，510640)2(上海煙草(集團(tuán))公司，上海，200082)

以O(shè)RAC法為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化制備大豆抗氧化肽*

曹亞蘭1，趙謀明1，鄭賽晶2，任嬌艷1

1(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州，510640)2(上海煙草(集團(tuán))公司，上海，200082)

以大豆分離蛋白為原料，用ORAC(oxyen radical absorbance capacity)法對(duì)3種商業(yè)蛋白酶(Alcalase、Neutrase、Pepsin)的酶解產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)估，以制備具有抗氧化能力的大豆肽。結(jié)果表明:在其適宜酶解條件下，Alcalase酶解產(chǎn)物的ORAC值最高，Neutrase次之，而Pepsin酶解產(chǎn)物的最低。Alcalase酶解產(chǎn)物ORAC最高值可達(dá)Trolox當(dāng)量1900.48μmol Trolox equivalent/g Peptide，谷胱甘肽當(dāng)量1711.91mg Glutathione equivalent/g Peptide，說明該條件下所制備的大豆肽具有非常好的抗氧化活性。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，利用ORAC法測(cè)定大豆肽的抗氧化活性結(jié)果與DPPH(1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl)法測(cè)定的結(jié)果具有顯著的相關(guān)性。

大豆肽，ORAC值，抗氧化性，DPPH自由基

大豆蛋白肽具有良好的抗氧化活性［1－4］。體外評(píng)價(jià)大豆肽抗氧化活性的方法有DPPH自由基清除率［1］、鄰苯三酚自氧化法［2］、羥自由基清除率［3］、還原力［4］等。近年來，除 ORAC 方法外，F(xiàn)RAP、TEAC及DPPH等其他一些方法也在抗氧化研究領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用［5］。由于這些方法的自由基來源不同、反應(yīng)機(jī)理不同、方法的準(zhǔn)確度不同，因而各有優(yōu)缺點(diǎn)。

ORAC(oxygen radical absorbance capacity)方法的研究和應(yīng)用已逐漸成為抗氧化研究領(lǐng)域中為人們所關(guān)注的熱點(diǎn)，該方法的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性及應(yīng)用范圍等與其他抗氧化活性分析方法相比具有諸多顯著的優(yōu)點(diǎn)，目前已成功應(yīng)用于生物樣品、植物或食品提取物以及純化合物等多種樣品的體內(nèi)外抗氧化能力分析。此外，研究發(fā)現(xiàn)，ORAC法與人類生物學(xué)相關(guān)最大，試管中得到的抗氧化能力更能反應(yīng)體內(nèi)的相關(guān)作用，通過改變自由基來源和溶劑可以評(píng)價(jià)親水性和親脂性體系的抗氧化能力［6］，應(yīng)用范圍廣，在各種化合物和食品樣品中均有應(yīng)用［7－8］。2004年在第一屆關(guān)于抗氧化方法的國(guó)際會(huì)議上提出了以O(shè)RAC法作為日常質(zhì)量控制和抗氧化活性分析的標(biāo)準(zhǔn)方法之一［6］。但是國(guó)際上ORAC法在肽的檢測(cè)上應(yīng)用很少，國(guó)內(nèi)對(duì)ORAC法的研究也較少。

實(shí)驗(yàn)中選用了3種有代表性的蛋白酶制備大豆蛋白肽，即酸性蛋白酶Pepsin、中性蛋白酶Neutrase、堿性蛋白酶Alcalase，以探討不同特性的蛋白酶對(duì)大豆蛋白的酶解特性。同時(shí)，用ORAC法評(píng)價(jià)制備大豆抗氧化肽，由于DPPH·是所有自由基中相對(duì)比較穩(wěn)定的自由基，該方法具有非常好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性［9］，操作簡(jiǎn)單，因此本文同時(shí)分析ORAC法與DPPH法在評(píng)價(jià)大豆肽抗氧化活性方面的相關(guān)性，探索評(píng)價(jià)大豆肽抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆分離蛋白，蛋白質(zhì)含量為90%以上;酸性蛋白酶Pepsin(測(cè)定酶活，3 800 U/g)由廣州合誠(chéng)實(shí)業(yè)有限公司提供;中性蛋白酶Neutrase 1.5MG，堿性蛋白酶Alcalase 2.4L FG(測(cè)定酶活，17.6×104U/g)由諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司提供;熒光物質(zhì)Fluorescein Sodium salt(3'，6'-dihydroxyspiro［isobenzofuran2 1［3H ］，9'［9H］-xanthen］-3-one，F(xiàn)L)、自由基產(chǎn)生劑 AAPH(2，2'-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride)、抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) Trolox(6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchr oman-2-carboxylic acid)、谷胱甘肽、DPPH(1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl)均購(gòu)于 Sigma公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

GL-21M高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;THZ-82A恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司;PHS-3C精密pH計(jì)，上海雷磁精密儀器廠;KDN-2C型定氮儀，上海纖檢儀器有限公司;KDN-40消化爐，上海新嘉電子有限公司;酶標(biāo)儀，光譜掃描多功能讀數(shù)儀，Thermo scientific(芬蘭)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解過程

按一定的底物濃度稱取大豆分離蛋白和水，加酶置于一定溫度下的搖床里。酶解后于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫，離心(3000 ×g，20 min)，上清液即為酶解液。

1.2.2 蛋白質(zhì)回收率的測(cè)定

采用凱氏定氮法(GB/T5009.5－2003)。

式中:N1為酶解上清液總氮量，g;N2為原料總氮量，g。

1.2.3 肽得率的測(cè)定

采用甲醛滴定法［10］。

分別用凱氏定氮法和甲醛滴定法測(cè)定上清液中的總氮含量和氨態(tài)氮含量，則肽得率按式(2)計(jì)算:

式中:N1為上清液總氮量，g;N2為上清液總氨態(tài)氮量，g;N3為原料總氮量，g。

1.2.4 水解度(DH)的測(cè)定

式中:AN為酶解液中游離氨態(tài)氮的量，g;AN0為酶解前游離氨態(tài)氮量，g;N為原料總氮量，g。

1.2.5 酶解產(chǎn)物抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 ORAC法

對(duì)Alcalase、Neutrase、Pepsin酶解大豆分離蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行 ORAC的測(cè)定，參照 Blanca Hernndez-Ledesma等人［11］的方法，并作適當(dāng)修改。在96孔熒光板各微孔中分別加入待測(cè)樣品20 μL(將各酶解產(chǎn)物用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液做適當(dāng)稀釋，每個(gè)樣品待測(cè)液濃度為0.08 mg/mL)后添加75 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液20 μL及70 nmol/L FL 20 μL，在37℃下預(yù)置15 min后，用多道移液器迅速在各孔中加入12 mmol/L AAPH 140μL啟動(dòng)反應(yīng)，并將微孔板置于酶標(biāo)儀中在37℃下以激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)538 nm進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，每2 min測(cè)定1次各孔熒光強(qiáng)度，測(cè)定時(shí)間設(shè)定在熒光衰減呈基線后為止，即設(shè)為2 h。

國(guó)際上ORAC值以Trolox當(dāng)量(μmol Trolox equivalent per g Peptide)來表達(dá)，本研究中的酶解產(chǎn)物用Trolox當(dāng)量表示則可以和其他類型的抗氧化劑做比較;谷胱甘肽的ORAC值在一定的范圍內(nèi)線性關(guān)系也較好，本文中的r值為0.9996，本研究中的酶解產(chǎn)物是肽，用還原型谷胱甘肽當(dāng)量(mg Glutathione equivalent per g Peptide)表達(dá)，可以很好地說明本研究中得到的大豆肽在抗氧化活性肽中的地位。

1.2.5.2 DPPH法

對(duì)Alcalase酶解大豆分離蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行DPPH·自由基清除率的測(cè)定，參照李瑩等人［12］的方法。測(cè)定5個(gè)濃度下的自由基清除率，經(jīng)線性回歸后計(jì)算出自由基清除率為50%時(shí)的蛋白濃度，即IC50值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析與相關(guān)性分析

除定量描述分析外，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果表述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。方差分析采用SPSS軟件(11.5版本，SPSS公司，美國(guó))中的 One-Way ANOVA進(jìn)行分析;相關(guān)性分析采用SPSS軟件中的Correlate進(jìn)行分析，用“*”標(biāo)記有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)系數(shù)，如果Sig.＜0.05則用1個(gè)“*”標(biāo)記，若Sig.＜0.01則用2個(gè)“*”標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的選擇

2.1.1 酶種類及酶解時(shí)間的確定

實(shí)驗(yàn)分別考察了酶解時(shí)間對(duì)Alcalase、Neutrase、Pepsin三種商業(yè)酶酶解大豆分離蛋白的酶解特性的影響，同時(shí)研究酶解時(shí)間對(duì)其酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響，分別如圖1(a～f)所示。

從圖1(a～c)可知，3種酶的酶解特性如下:酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)回收率與肽得率按從大到小順序是:Alcalase＞Pepsin＞Neutrase，酶解產(chǎn)物中DH按從大到小順序是:Alcalase＞Neutrase＞Pepsin;3種酶酶解液中蛋白質(zhì)回收率、肽得率、DH達(dá)到最大值時(shí)的時(shí)間分別為:Alcalase 12h，Pepsin 4h，Neutrase 12h，隨時(shí)間延長(zhǎng)各指標(biāo)均變化不大。Alcalase酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)回收率、肽得率、DH均最高，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Alcalase對(duì)蛋白羧端疏水性氨基酸有較強(qiáng)的專一性，可裂解蛋白分子中含 Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和 Gln 的羧端肽鍵［13］，由此可知堿性蛋白酶有著相對(duì)廣泛的作用位點(diǎn)，故其酶解效果最佳。

從圖1(d、e)可知，3種酶的抗氧化活性如下:Alcalase酶解4h時(shí)其酶解產(chǎn)物ORAC值可達(dá)1710.99μmol Trolox equivalent/g Peptide(以 Trolox當(dāng)量表示)，1535.9mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽當(dāng)量表示)，均高于Pepsin、Neutrase酶解產(chǎn)物的最優(yōu)值，原因可能是由于Alcalase有著相對(duì)廣泛的作用位點(diǎn)，酶解效果好，酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸末端肽和小分子肽含量較高。與別的食品抗氧化活性相比，如 Carlos Aguilar-Garcia［14］研究發(fā)現(xiàn)，米糠的 ORAC 值在 18μg TE/mL，Alberto Dávalos［15］研究中紅葡萄果汁的ORAC值高達(dá)25.0μmol TE/mL，本研究中的大豆肽的抗氧化活性可以說是搖搖領(lǐng)先，同時(shí)1g大豆肽的抗氧化活性相當(dāng)于1.7g的谷胱甘肽，說明大豆肽是一種良好的抗氧化活性肽。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)酶解特性及產(chǎn)物抗氧化活性的影響

從圖1(d、f)可知，2種抗氧化方法關(guān)系如下:Alcalase酶解4h時(shí)其酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的IC50值最小為7.64mg/mL，該條件下酶解產(chǎn)物清除DPPH·能力較強(qiáng)，其變化趨勢(shì)與酶解產(chǎn)物ORAC值變化趨勢(shì)一致，2種抗氧化性具有一定的相關(guān)性。

篩選出Alcalase，進(jìn)一步研究其酶解條件，使其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性達(dá)到最優(yōu)，并進(jìn)一步探討ORAC值與清除DPPH·之間的相關(guān)性。

2.1.2 底物蛋白濃度的確定

考察了底物蛋白濃度對(duì)Alcalase酶解大豆分離蛋白的酶解特性的影響，同時(shí)研究底物蛋白濃度對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響，如圖2(a～c)所示。

從圖2a可知，隨著底物蛋白濃度的增加，Alcalase酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)回收率及肽得率均逐步下降，其DH卻緩慢上升，這可能是因?yàn)殡S底物蛋白濃度的增加，蛋白質(zhì)殘留在渣中的含量升高，酶解液中的相對(duì)含量減少。

從圖2b可知，底物蛋白濃度為6%時(shí)，Alcalase酶解產(chǎn)物ORAC值可達(dá)1 903.84μmol Trolox equivalent/g Peptide(以Trolox當(dāng)量表示)，1 569.3mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽當(dāng)量表示)。

從圖2(b、c)可知，底物蛋白濃度為6%時(shí)，Alcalase酶解產(chǎn)物清除DPPH·的IC50值為7.98mg/mL，與最優(yōu)值7.74mg/mL很接近，而且酶解產(chǎn)物清除DPPH·的變化趨勢(shì)與ORAC值變化趨勢(shì)也近乎一致，進(jìn)一步證明2種抗氧化性具有一定的相關(guān)性。

圖2 底物蛋白濃度對(duì)酶解特性及產(chǎn)物抗氧化活性的影響

圖3 加酶量對(duì)酶解特性及產(chǎn)物抗氧化活性的影響

2.1.3 加酶量的確定

實(shí)驗(yàn)考察了加酶量對(duì)Alcalase酶解大豆分離蛋白的酶解特性的影響，同時(shí)研究底物蛋白濃度對(duì)其酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響，分別如圖3(a～c)所示。

從圖3a可知，隨著加酶量的增加，Alcalase酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)回收率及肽得率均先下降后逐步上升，其DH先緩慢上升后少有下降，這是因?yàn)殡S加酶量的增加，酶與底物蛋白接觸充分，有利于酶解，但是當(dāng)加酶量達(dá)到一定程度后，幾乎所有的酶分子都與底物結(jié)合，呈現(xiàn)“飽和”現(xiàn)象，加酶量的進(jìn)一步增加，并不會(huì)作用于底物蛋白，不會(huì)有利于其酶解，而且還會(huì)有一定程度的抑制作用。

從圖3b可知，加酶量為0.8%時(shí)，Alcalase酶解產(chǎn)物ORAC值可達(dá)1900.48μmol Trolox equivalent/g Peptide(以Trolox當(dāng)量表示)，1711.91mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽當(dāng)量表示)。

從圖3(b、c)可知，加酶量為0.8%時(shí)，Alcalase酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的IC50值為7.08/mL，為其最優(yōu)值，而且酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的變化趨勢(shì)與ORAC值變化趨勢(shì)也是一致，進(jìn)一步驗(yàn)證2種抗氧化性具有一定的相關(guān)性。

2.2 相關(guān)性分析

對(duì)Alcalase酶解產(chǎn)物的ORAC值與其清除DPPH·的IC50值之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，其Pearson相關(guān)系數(shù)為－0.753(＊＊)，其相關(guān)系數(shù)的Sig.為0.001，小于0.01，所以 ORAC值與 IC50值在雙邊檢測(cè)中0.01水平上負(fù)相關(guān)性是顯著的，即用ORAC法與DPPH法評(píng)價(jià)大豆肽的抗氧化性大小具有一致性，這與Ichiho MikaMi等［16］的報(bào)道一致，其研究用胡蘿卜素漂白法、DPPH法、ORAC法3種方法評(píng)價(jià)11種農(nóng)作物的抗氧化性，發(fā)現(xiàn)用DPPH法與ORAC法得到的抗氧化值具有很強(qiáng)的相關(guān)性(0.948＜r＜0.999)。

3 結(jié)論

用3 種商業(yè)酶(Alcalase、Neutrase、Pepsin)酶解大豆分離蛋白制備抗氧化大豆肽，在各自適宜酶解條件下，酶解產(chǎn)物的ORAC值大小順序?yàn)?Alcalase＞Neutrase＞Pepsin;底物蛋白濃度［S］為6%(W/W)，加酶量［E］/［S］為0.8%(W/W)，Alcalase酶解 4h時(shí)，酶解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性，其ORAC值可高達(dá)1 900.48μmol Trolox equivalent/g Peptide(以 Trolox當(dāng)量表示)，1 711.91mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽當(dāng)量表示)。并且驗(yàn)證了大豆肽的ORAC值與其清除DPPH·的能力具有顯著的相關(guān)性。用ORAC值表達(dá)大豆肽的抗氧化性更具科學(xué)性，其分析方法具有很強(qiáng)的生物相關(guān)性，因此用ORAC法評(píng)價(jià)大豆肽的抗氧化活性是可行的，為建立標(biāo)準(zhǔn)的大豆肽抗氧化評(píng)價(jià)方法提供理論依據(jù)。

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Optimization on Preparation of Soybean Antioxidative Peptide with ORAC Assay of Evaluation

Cao Ya-lan1，Zhao Mou-ming1，Zheng Sai-jing2，Ren Jiao-yan1，
1(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)2(Shanghai Tobacco(Group)Corporation，Shanghai 200082，China)

With isolated soybean protein as raw material，three commercial proteases(Alcalase，Neutrase，Pepsin)were used to prepare soybean peptides with antioxidant ability.The antioxidant capacities(AOC)of enzymatic hydrolysates were evaluated by ORAC(oxyen radical absorbance capacity).The results showed that，in the appropriate enzymatic condition，the ORAC value of the hydrolysate zymolysised by Alcalase，which was1 900.48 μmol Trolox equivalent/g Peptide，1 711.91 mg Glutathione equivalent/g Peptide，was the highest，that by Neutrase took the second place，and that of Pepsin was the lowest.At the same time，the significant correlation between ORAC value of soybean peptide and its DPPH radical scavenging capacity was found.

soybean peptide，ORAC，antioxidant capacity，DPPH radical

碩士研究生(任嬌艷為通訊作者)。

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31000759)及上海煙草(集團(tuán))公司煙草行業(yè)卷煙煙氣重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(No.SZBCW2010－00473)

2011－06－23，改回日期:2011－08－15