增強毛霉菌的細胞通透性對腺嘌呤合成ATP的影響

朱家榮，楊光輝，楊善巖，裘娟萍

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州，310032)

增強毛霉菌的細胞通透性對腺嘌呤合成ATP的影響

朱家榮，楊光輝，楊善巖，裘娟萍

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州，310032)

采用雅致放射毛霉轉(zhuǎn)化腺嘌呤合成ATP，系統(tǒng)地研究了菌體通透化方法，考察了它對腺嘌呤轉(zhuǎn)化率、ATP產(chǎn)量的影響，篩選出較佳方法，并采用電導率法驗證菌體通透性的改變情況。結(jié)果表明，通過干燥方法處理毛霉菌體，在含有3 g/L腺嘌呤的反應液中，轉(zhuǎn)化生成10.13 g/L ATP，腺嘌呤轉(zhuǎn)化率為82.76%，比對照組提高202.39%;干燥處理后的毛霉菌體的電導率顯著提高，且電導率隨干燥時間的變化趨勢與ATP產(chǎn)量隨干燥時間的變化趨勢基本吻合，表明干燥方法真實地提高了毛霉菌的通透性，進而提高了腺嘌呤轉(zhuǎn)化率及ATP產(chǎn)量。

干燥法，有機溶劑，表面活性劑，電導率

細胞膜控制著細胞外物質(zhì)的進入和細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的排出，一般相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)如葡萄糖、Na+等通過滲透作用或主動運輸通過細胞膜，但某些相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)如ATP不能通過細胞膜［1］。因此在生物合成過程中，提高菌體細胞膜的通透性不僅有利于底物吸收和產(chǎn)物排泄，還有利于降低胞內(nèi)產(chǎn)物濃度，減少或解除產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)，從而提高產(chǎn)物產(chǎn)量。

細胞通透化處理即改善細胞膜的通透性，可以有效解除其滲透障礙，通透化細胞通常仍保持形態(tài)完整性，但由于細胞膜受到破壞，其對高分子量物質(zhì)的滲透障礙被部分或完全解除［2］。細胞膜通透化方法分為物理方法和化學方法，物理方法包括空氣干燥［3］、滲透壓沖擊［4］、溫度沖擊［5］、電處理［6－8］、超聲波處理［9－10］等，物理方法無毒，環(huán)保，但在生產(chǎn)操作上有一定的難度。化學方法則是通過添加化學物質(zhì)改善菌體細胞膜的通透性，促進細胞外底物的攝入及細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的排出，根據(jù)添加劑的種類分為有機溶劑法、表面活性劑法等。有機溶劑法常用甲苯［11］、二甲基亞砜(DMSO)［12］、異丙醇［13］等，與有機溶劑法相比，表面活性劑法［14］毒性較低，用以提高菌體通透性有一定的優(yōu)勢?；瘜W方法操作簡便，但是一定程度上受到環(huán)保、安全的限制。

ATP是生物細胞生命活動能量的直接來源，臨床上廣泛用作細胞激活劑［15］，近期ATP的促進細胞壞死和凋亡［16］、抗癌［17］等作用受到關(guān)注。目前國內(nèi)外主要采用生物法生產(chǎn)ATP，而采用雅致放射毛霉轉(zhuǎn)化腺嘌呤合成ATP的工藝尚未見諸報道。毛霉菌具有豐富的酶系，采用毛霉菌生物合成ATP具有菌體易培養(yǎng)、生長速度快、便于分離收集等優(yōu)點，但是該工藝存在腺嘌呤轉(zhuǎn)化率、ATP產(chǎn)量較低等問題，而改善毛霉菌細胞膜的通透性是提高腺嘌呤轉(zhuǎn)化率及ATP產(chǎn)量的重要途徑。目前毛霉菌的通透性對ATP生產(chǎn)活性的影響未見系統(tǒng)研究報道，本文以雅致放射毛霉為菌種，較系統(tǒng)地研究毛霉菌通透化方法，以期獲得較佳的提高菌體通透性方法，為生物法高效合成ATP提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

腺嘌呤(上?；瘜W試劑公司，質(zhì)量分數(shù)≥98.0%，文中使用量未扣除雜質(zhì));其他試劑均為化學純或生化試劑。

SCR－3型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀，江蘇丹陽無線電一廠;紫外分析儀，上海科藝光學儀器廠;Gold Spectru mlab 54紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司;CV－33超聲波細胞破碎儀，Sonics＆Materials，Inc.;數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海申勝生物技術(shù)有限公司;TGL 16M高速離心機，長沙湘智離心機儀器儀表有限公司;DDSJ－308A型電導率儀，上海精密科學儀器有限公司－雷磁儀器廠。

1.2 菌種

雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)。

1.3 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20，蛋白胨 10，酵母膏 5，NaCl 5，瓊脂 2，pH 6.0 ～6.5。

搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨 10，酵母膏 5，NaCl 5，pH 6.0 ～6.5。

菌體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40，酵母膏3，玉米漿10，MgSO4·7H2O 1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2，NH4Cl 3，K2HPO4·3H2O 3，pH 6.0 ～6.5。

1.4 菌體培養(yǎng)及收集

將活化后的斜面菌種制成孢子懸浮液，以10%(V/V)的接種量接入100 mL搖瓶種子培養(yǎng)基中，置于28℃，160 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)12 h。以10%(V/V)的接種量將上述種子液接入300 mL菌體培養(yǎng)基中，置于28℃，160 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵結(jié)束，過濾收集菌體，用0.9%(W/V)生理鹽水洗滌3次，擠干水分至菌體恒重，作為轉(zhuǎn)化合成ATP的菌體。

1.5 轉(zhuǎn)化反應

1.5.1 反應液(g/L)

葡萄糖 90，Na2HPO4·12H2O 90，MgCl2·6H2O 4，腺嘌呤3，毛霉菌體400。

1.5.2 反應方法

稱取毛霉菌體，加入反應液中，攪拌均勻，置于33℃，160 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中，轉(zhuǎn)化反應6 h后，每隔2 h用紙電泳法檢測轉(zhuǎn)化反應情況［18－19］。

1.6 產(chǎn)物分析及計算

取樣5 μL，點樣在20 mm寬的普通濾紙上，以pH 2.5檸檬酸－檸檬酸鈉溶液(C6H8O7·H2O 9 g/L，C6H5Na3O7·2H2O 1 g/L)為緩沖液，電壓梯度為400 V，電泳45 min。電泳結(jié)束后，用吹風機吹干濾紙，在紫外分析儀下劃出與標準ATP斑點相同位置的產(chǎn)物斑點，將斑點剪成2 mm左右的細條，用5 mL 0.01 mol/L HCl于28℃，160 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中浸提4 h，測定浸提液在260 nm波長下的吸光度(OD260)。

式中:MrATP為ATP的相對分子質(zhì)量;C為稀釋倍數(shù)(浸提液體積/樣品點樣體積);EATP為ATP摩爾吸光系數(shù)［1.43×104L/(mol·cm)］。轉(zhuǎn)化率(%)，即摩爾轉(zhuǎn)化率，數(shù)值等于實際ATP產(chǎn)量與理論ATP產(chǎn)量之比。

1.7 物理方法的篩選

干燥方法［3］:稱取毛霉菌體，將菌體撕成薄片，均勻地散布于培養(yǎng)皿中，用吹風機吹至恒重，用于轉(zhuǎn)化反應。

超聲波方法［23］:稱取毛霉菌體，均勻地懸浮于反應液中，置于冰水浴中，用超聲波間隙短時處理，用于轉(zhuǎn)化反應。超聲作用參數(shù):頻率為20 kHz，功率為500 W，超聲的作用時間為每次3 s，間隔時間為4 s，作用的總時間為900 s。

冷凍方法［5］:稱取毛霉菌體，將菌體撕成薄片，均勻地散布于培養(yǎng)皿中，置于－20℃冰箱中冷凍處理24 h，用于轉(zhuǎn)化反應。

水浴加熱法:稱取毛霉菌體，均勻地懸浮于反應液中，置于60℃恒溫水浴鍋中處理2 h，用于轉(zhuǎn)化反應。

電處理方法［6－8］:電處理具體參數(shù)為:電壓 20 V，功率1 W，搖瓶容積100 mL，鉑電極直徑0.5 mm，電極間距5 cm，電極浸入液面下1 cm。菌體通透化操作過程為:稱取毛霉菌體，均勻地懸浮于反應液中，施加50 mA直流電處理2 h，用于轉(zhuǎn)化反應。

1.8 化學方法的篩選

1.8.1 有機溶劑法的篩選

有機溶劑的種類:二甲苯、甲苯、戊二醛、三氯甲烷、丙烯酸、丙酮。

1.8.2 表面活性劑法的篩選

表面活性劑的種類:新潔爾滅、吐溫60、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、溴化十六烷吡啶、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺(6501)、D-山梨醇、十二烷基苯磺酸鈉、硬脂酸、硬脂酸單甘油酯、咪唑、十二烷基磺酸鈉(SDS)。

1.9 電導率法考察菌體通透性

采用電導率法考察菌體細胞膜的通透性［24］。DDSJ－308A型電導率儀的相關(guān)參數(shù):電極為DJS－1C型電導電極(鉑黑)，電極常數(shù)為1.0 cm－1，測量范圍為20.0～19.9 mS/cm。

1.9.1 干燥處理后菌體通透性的測定

過濾收集菌體，首先將菌體用超純水洗滌3次，擠干水分至菌體恒重，稱取3 g菌體，置于65℃烘箱中干燥處理180 min，取出稱重，然后懸浮于30 mL超純水中，菌體因干燥損失的水分用超純水補足，再置于28℃，160 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中恒溫振蕩2 h，最后將菌體懸浮液離心(8 000 r/min，15 min)，上清液用于測定電導率。

1.9.2 二甲苯處理后菌體通透性的測定

過濾收集菌體，首先將菌體用超純水洗滌3次，擠干水分至菌體恒重，稱取3 g菌體，懸浮于30 mL超純水中，然后加入1%的二甲苯，搖勻，再置于28℃，160 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中恒溫振蕩2 h，最后將菌體懸浮液離心(8000 r/min，15 min)，上清液用于測定電導率。

1.9.3 溴化十六烷吡啶處理后菌體通透性的測定

過濾收集菌體，首先將菌體用超純水洗滌3次，擠干水分至菌體恒重，稱取3 g菌體，懸浮于30 mL超純水中，然后加入0.2%的溴化十六烷吡啶，搖勻，再置于28℃，160 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中恒溫振蕩2 h，最后將菌體懸浮液離心(8000 r/min，15 min)，上清液用于測定電導率。

2 結(jié)果與分析

2.1 物理方法的篩選及優(yōu)化

以物理方法處理菌體，會對細胞壁和細胞膜產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性破壞，從而提高菌體的通透性［3］。采用干燥法、超聲波法、冷凍法、水浴加熱法、電處理方法處理毛霉菌體，反應后測定腺嘌呤轉(zhuǎn)化率及ATP產(chǎn)量，以未經(jīng)處理的毛霉菌體為對照，篩選物理通透化方法，結(jié)果見表1。冷凍方法對轉(zhuǎn)化反應無促進作用，且工業(yè)生產(chǎn)中的可操作性差;超聲波方法的可操作性較差;水浴加熱方法、電處理方法的可操作性較佳，但經(jīng)過優(yōu)化發(fā)現(xiàn)對轉(zhuǎn)化反應的促進作用不顯著;干燥方法可以顯著提高腺嘌呤轉(zhuǎn)化率及ATP產(chǎn)量，且工業(yè)生產(chǎn)中具有較佳的可操作性，故選取干燥方法進行優(yōu)化研究。

表1 各種物理方法對轉(zhuǎn)化反應的影響

2.1.1 干燥溫度的優(yōu)化

稱取毛霉菌體，將菌體撕成薄片，均勻地散布于培養(yǎng)皿中，分別置于 30，40，50，60，65，70，80 ℃ 烘箱中烘干至恒重，用于轉(zhuǎn)化反應，以確定干燥溫度，結(jié)果見圖1。當干燥溫度為65℃時，腺嘌呤轉(zhuǎn)化率、ATP產(chǎn)量較高。

2.1.2 干燥時間的優(yōu)化

稱取毛霉菌體，將菌體撕成薄片，均勻地散布于培養(yǎng)皿中，分別置于65℃烘箱中持續(xù)烘干30，60，90，120，150，180，210，240 min，用于轉(zhuǎn)化反應，以確定較佳的干燥時間，結(jié)果見圖2。當干燥時間為180 min時，腺嘌呤轉(zhuǎn)化率、ATP產(chǎn)量較高，分別為82.76%、10.13 g/L，比對照組提高202.39% 。

2.2 化學方法的篩選及優(yōu)化

2.2.1 有機溶劑的篩選

圖2 干燥時間對轉(zhuǎn)化反應的影響

有機溶劑可以透過菌體細胞膜的脂質(zhì)體，通過內(nèi)反應破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)體的流動性，使細胞膜失去原有的傳遞細胞內(nèi)外物質(zhì)的調(diào)控能力，從而提高菌體的通透性［3］。向反應液中分別加入不同的有機溶劑，每種有機溶劑的加量分為0.1%，0.5%，1%，攪拌均勻，置于33℃，160 r/min的搖床中轉(zhuǎn)化，反應后測定腺嘌呤轉(zhuǎn)化率及ATP產(chǎn)量，以原始反應液為空白對照，篩選較佳的有機溶劑，結(jié)果見表2。二甲苯、甲苯、三氯甲烷、戊二醛對轉(zhuǎn)化反應均有不同程度的促進作用，其中二甲苯的促進作用較顯著，故選擇二甲苯，對其用量進行進一步的優(yōu)化。

表2 各種有機溶劑對轉(zhuǎn)化反應的影響

2.2.2 二甲苯用量的優(yōu)化

向反應液中分別加入 0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%的二甲苯，反應后測定腺嘌呤轉(zhuǎn)化率及ATP產(chǎn)量，結(jié)果見圖3。當二甲苯的用量為1.0%時，腺嘌呤轉(zhuǎn)化率、ATP產(chǎn)量較高，為62.17%，7.61 g/L，比對照組提高130.61%。二甲苯有毒，并有一定的致癌性，工業(yè)生產(chǎn)上應盡量減少其用量。

圖3 二甲苯用量對轉(zhuǎn)化反應的影響

2.2.3 表面活性劑的篩選

表面活性劑是具有固定的親水親油基團，可以在溶液的表面定向排列，而且可使溶液的表面張力顯著下降的物質(zhì)，因毒性相對較低，用以提高菌體通透性有一定的優(yōu)勢。向反應液中分別加入不同表面活性劑，每種表面活性劑的加量分為 0.1%，0.5%，0.1%，攪拌均勻，置于33℃，160 r/min的搖床中轉(zhuǎn)化，反應后測定腺嘌呤轉(zhuǎn)化率及ATP產(chǎn)量，以原始反應液為空白對照，篩選較佳的表面活性劑，結(jié)果見表3。新潔爾滅、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、溴化十六烷吡啶、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺(6501)、十二烷基苯磺酸鈉、硬脂酸單甘油酯對轉(zhuǎn)化反應對轉(zhuǎn)化反應均有不同程度的促進作用，其中溴化十六烷吡啶的促進作用較顯著，故選擇溴化十六烷吡啶，對其用量進行進一步優(yōu)化。

表3 各種表面活性劑對轉(zhuǎn)化反應的影響

2.2.4 溴化十六烷吡啶用量的優(yōu)化

向反應液中分別加入 0.1%，0.2%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%的溴化十六烷吡啶，反應后測定腺嘌呤轉(zhuǎn)化率及ATP產(chǎn)量，結(jié)果見圖4，當溴化十六烷吡啶用量為0.2%時，腺嘌呤轉(zhuǎn)化率、ATP產(chǎn)量最大，分別為 47.47%、5.81 g/L，比對照組提高81.56%，繼續(xù)增加溴化十六烷吡啶的用量，腺嘌呤轉(zhuǎn)化率、ATP產(chǎn)量迅速下降，故溴化十六烷吡啶用量以0.2%為宜。

圖4 溴化十六烷吡啶用量對轉(zhuǎn)化反應的影響

2.3 電導率法考察菌體通透性

細胞膜是活細胞和外界環(huán)境之間的屏障，外界環(huán)境破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)的物質(zhì)外滲，尤其是電解質(zhì)的外滲，會引起外界環(huán)境的電導值增加，因此菌體細胞膜的通透性可以用電導率法來考察［24］。

對于上述通透化方法中ATP產(chǎn)量較高的干燥、二甲苯、溴化十六烷吡啶3種通透化方法，分別采用電導率法考察驗證其菌體通透性改變情況。按方法1.9考察3種通透化方法處理的菌體細胞膜通透性，結(jié)果見表3和圖5。由表3可見，通透化處理組的電導率明顯大于未通透化處理的對照組，由圖5可見，電導率隨干燥時間的變化趨勢與ATP產(chǎn)量隨干燥時間的變化趨勢基本吻合，證明分別單獨采用干燥、添加二甲苯或溴化十六烷吡啶的通透化方法，均真實地提高了毛霉菌細胞膜的通透性，進而提高了腺嘌呤轉(zhuǎn)化率及ATP產(chǎn)量。

表3 三種處理方法對菌體通透性的影響

圖5 干燥時間對電導率及ATP產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論

(1)分別單獨采用干燥方法、二甲苯、溴化十六烷吡啶處理毛霉菌體均可顯著提高菌體通透性、腺嘌呤轉(zhuǎn)化率及ATP產(chǎn)量，干燥方法效果最佳，在含有3 g/L腺嘌呤的反應液中，轉(zhuǎn)化合成10.13 g/L ATP，腺嘌呤轉(zhuǎn)化率為82.76%，比對照組提高202.39%。

(2)二甲苯可以顯著提高ATP產(chǎn)量，但二甲苯毒性強、用量大，制約了其在工業(yè)生產(chǎn)上的應用;溴化十六烷吡啶對ATP合成的促進作用雖不如干燥方法或二甲苯，但其毒性低、用量少、操作簡便，亦具有一定的應用價值。干燥方法與添加二甲苯或溴化十六烷吡啶相比，操作過程比較繁瑣，但是干燥方法更加高效，無毒，環(huán)保，且利于ATP的分離提取，實驗中發(fā)現(xiàn)添加二甲苯或溴化十六烷吡啶，轉(zhuǎn)化反應時間只能維持10～12 h，超過12 h，ATP開始分解，ATP產(chǎn)量顯著降低，而干燥方法處理菌體，反應時間可適當延長，推測干燥方法對菌體內(nèi)相關(guān)酶的破壞程度相對較低，使反應過程中相關(guān)酶活力更加穩(wěn)定。

(3)目前國內(nèi)外關(guān)于ATP的研究多是采用化學方法(添加有機溶劑或表面活性劑或二者復合)以提高菌體通透性，但有機溶劑或表面活性劑都有一定的毒性，不僅污染環(huán)境，危害人體健康，而且會給ATP的分離提取造成一定的困難，干燥方法雖已有研究，但由于菌種、工藝等原因而效果欠佳［3］，本文通過系統(tǒng)研究毛霉菌通透化方法，篩選出一種更加高效且綠色環(huán)保的干燥方法，使反應過程中相關(guān)酶活力更加穩(wěn)定，且利于ATP的分離提取，有效解決了化學方法的不足之處，具有廣闊的應用前景。

［1］ Felix H R.Permeabilized cells［J］.Anal Biochem，1982，120:211－234.

［2］ 羅杰.細胞通透性的改變及其應用［J］.微生物學報，2001，41(3):386－389.

［3］ 段學輝，葉勤，張嗣良.啤酒酵母的通透性對ATP生產(chǎn)活性的影響［J］.華東理工大學學報，2000，26(1):33－36.

［4］ Smith J I，Smart N J，Kurz W G W，et al.Development of a single－sage growth and indole alkaloid production medium for Catharanthus roseus(L.)G don suspension cultures［J］.Enzyme and Microbial Technology，1987，9(8):466－469.

［5］ Park K H，Chang P S，Chung S H.Production of cell wall lytic enzyme from Fusarium moniliforme［J］.Biotechnology Lett，1990，4(1):106.

［6］ Zimmermann U.Monolayer adsorption and thin film growth of big aromatic molecules on Si(Ⅲ)［J］.Biophys，1991，14:881－899.

［7］ She P，Song B，Van Loosdrecht M，et al.Electrolytic Stimulation of Bacteria Enterobacter dissolvens by a direct current［J］.Biochem Eng J，2006，28:23 －29.

［8］ 王福遠，苗長春，韓慧龍，等.電場對黃孢原毛平革菌生長、細胞通透性及其胞外酶反應的影響［J］.過程工程學報，2007，7(2):385－389.

［9］ Rapoport N，Smironoy A，Itimoshin A，et al.Factors affecting the permeability of Pseudomonas aeruginosa cell walls toward lipophilic compounds:effects of ultrasound and cell age［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics1，1997，344(1):114－124.

［10］ Joersbo，Morten，Brunstedt.Protein synthesis stimulated in sonicated sugar beet cells and protoplasts［J］.Ultrasound in Medicine and Biology，1990，16(7):719 －724.

［11］ Takeshige K，Ouchi K.Reconstruction of ethanol fermentation in permeabilized cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae［J］.J Ferm Bioeng，1995，79:11 － 16.

［12］ Zhong J J，Meng X D，Zhang Y H，et al.Effective release of ginseng saponin from suspension cells of Panax no toginseng［J］.Biotechnol Tech，1997，11(4):241 －243.

［13］ Liu Y，Hama H，F(xiàn)ujita Y，et al.Production of S－lactoylglutathione by high activity whole cell biocatalysts prepared by permeabilization of recombinant Saccharomyces cerevisiae with alcohols［J］.Biotechnol Bioeng，1999，64:54－60.

［14］ Prabhune A A，Rao B S，Pundle A V，et al.Immobilization of permeabilized Escherichia colicells with penicillin acylase activity［J］.Enzyme Microb Technol，1992，14(2):161－163.

［15］ Marriage B J，Clandinin M T，Macdonald IM，et al.Cofactor treatment improves ATP synthetic capacity in patients with oxidative phosphorylation disorders［J］.Mol Genet Metab，2004，81(4):263－272.

［16］ Pao W，Miller V A.Epidermal growth factor receptor mutations，small － molecule kinase inhibitors，and non －small－cell lung cancer:current knowledge and future direction［J］.J Clin Oncol，2005，23(11):2556.

［17］ Rosalyn D.Chemosensitivity testing using microplate adenosine triphosphate－based luminescence measurements.Methods in molecular medicineTM，chemosensitivity volume 1:in vitro assays［M］.Human Press Inc，2005，110:101－120.

［18］ 劉翠英.電泳法測定ATP含量及影響因素的討論［J］.海峽藥學，2000，12(1):102 －103.

［19］ 范利華.ATP的生物合成與分離研究［D］.廣西:廣西大學，2002.

［20］ 邱蔚然，徐茜，張玉玲，等.利用固定化酵母細胞生產(chǎn)ATP［J］.華東化工學院學報，1991，17(4):421－425.

［21］ 朱家榮，裘娟萍，錢鈺，等.提高毛霉菌轉(zhuǎn)化合成腺三磷產(chǎn)率的研究［J］.工業(yè)微生物，2003，33(1):31－33.

［22］ 袁玉蓀，朱婉華，陳鈞輝.生物化學實驗［M］.北京:人民教育出版社，1979:85－87.

［23］ Wales M R，F(xiàn)ewson C A.NADP－dependent alcohol dehydrogenases in bacteria and yeast:purification and partial characterization of the enzymes from Acinetobacter calcoaceticus and Saccharomyces cerevisiae［J］.Microbiology，1994，140:173.

［24］ 畢秋艷，馬志強，張小風，等.福美雙和戊唑醇增效與拮抗組合對小麥赤霉病菌細胞膜透性及內(nèi)含物滲漏的影響［J］.中國農(nóng)學通報，2009，25(20):222－227.

Effects of Cell Permeability on the Activity of Actinomucor elegans for ATP Production from Adenine

Zhu Jia-rong，Yang Guang-hui，Yang Shan-yan，Qiu Juan-ping
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China)

Methods related to the modification of cell permeability were studied systematically in Actinomucor elegans.The correlation between cell membrane permeability determined by electrical conductivity method and cell enzymatic activity for ATP production from adenine was investigated.As a result，drying method was selected.After optimization by drying method in production process，10.13 g/L ATP was accumulated from 3 g/L adenine and the molar conversion ratio was 82.76%，which increased by 202.39%compared with the control group.Electrical conductivity of treatment group was obviously higher than that of the control group and the correlation between electrical conductivity and drying time was alike with the correlation between ATP production and drying time，which proved that drying method increased cell membrane permeability and ATP production.

drying method，organic solvent，surfactant，electrical conductivity

學士，副教授(本文通訊作者)。

2011－05－16，改回日期:2011－06－23