發(fā)芽對大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響

王素雅，趙甲慧，鞠興榮，陳波

(南京財經(jīng)大學食品學院，江蘇省糧油食品檢測與深加工重點實驗室，江蘇南京，210046)

發(fā)芽對大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響

王素雅，趙甲慧，鞠興榮，陳波

(南京財經(jīng)大學食品學院，江蘇省糧油食品檢測與深加工重點實驗室，江蘇南京，210046)

研究了發(fā)芽大豆蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)的變化。采用堿提酸沉法制備大豆分離蛋白(SPI)，以葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL)為凝固劑制備大豆蛋白凝膠，系統(tǒng)研究了不同芽長大豆蛋白凝膠強度的變化。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜分析了發(fā)芽過程中SPI的變化及其對大豆凝膠強度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):SPI中7S球蛋白的α＇、α亞基和11S球蛋白的酸性亞基A3、A發(fā)芽時發(fā)生明顯降解，但11S球蛋白各亞基在發(fā)芽初期變化小，利于大豆蛋白質(zhì)分子之間形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使凝膠強度增強。隨著發(fā)芽時間的延長，11S球蛋白也部分發(fā)生降解，凝膠強度下降。

發(fā)芽，SPI，大豆蛋白凝膠，SDS-PAGE

大豆是一種深受亞洲人民喜愛的良好食物來源，其不僅富含蛋白質(zhì)、氨基酸組成比例合適，而且還含有豐富的不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)，以及大豆低聚糖、異黃酮、皂苷生理活性物質(zhì)。但大豆組織堅固，且含有胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素、植酸等抗營養(yǎng)因子，影響了人類對其營養(yǎng)素的充分消化和利用，因此需要適當加工后方可食用。

已有的研究表明發(fā)芽能調(diào)整大豆的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，發(fā)芽后大豆中總蛋白［1］、必需氨基酸與非必需氨基酸含量增加［2］，而纖維素、木質(zhì)素減少［3］。發(fā)芽還能促進大豆中功能因子如大豆異黃酮［4］、VC、VB2、尼克酸、VB6、γ-氨基丁酸［5］、多酚［6］等增加，而降低抗營養(yǎng)因子如植物凝集素［7］、胰蛋白酶抑制因子的含量［8］，從而大大提高大豆中各種營養(yǎng)素的消化利用率。

豆腐制品種類繁多，是大豆最重要的加工品種，也是大豆凝膠的重要表現(xiàn)形式。大豆凝膠是指大豆蛋白在加熱變性后聚集形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。凝膠強度反映大豆的凝固狀態(tài)，是鑒定其品質(zhì)高低的重要指標，而SPI是影響大豆凝膠形成的主要因素［9］。大豆發(fā)芽后，蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)發(fā)生變化，將影響大豆蛋白凝膠性能。因此，本文以大豆為原料，研究發(fā)芽過程中大豆凝膠性質(zhì)隨發(fā)芽時間和發(fā)芽長度的變化規(guī)律，并分離大豆分離蛋白，探討大豆蛋白變化對其凝膠性能的影響。

1 原料、試劑及設(shè)備

1.1 實驗原料與藥品

1.1.1 原料

大豆:東北穆豐山，購自南京原糧市場;葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL):江蘇常州康力食品添加劑廠。

1.1.2 藥品

氫氧化鈉，石油醚，乙醚，乙醇，次氯酸鈉，甘油，異丙醇，苯酚，硫酸，甘氨酸，丙烯酰胺，N，N'-甲叉雙丙烯酰胺，三羥甲基氨基甲烷 (Tris)，四甲基乙二胺(TEMED)，考馬斯亮藍 R250，十二烷基硫酸鈉(SDS)，過硫酸銨，β-巰基乙醇，溴酚藍，以上所用試劑均為分析純(AR)或生化試劑。

標準蛋白(protein marker):California Bioscience。

1.2 實驗儀器設(shè)備

HG75-3型電熱恒溫兩用箱，南京實驗儀器廠;PHS-25型pH計，上海精密科學儀器有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;HH-6型恒溫水浴鍋，常州市國華電器有限公司;TDL-80-2B型離心分離機，上海安亭科學儀器廠;FW100型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;AIPHAI-4LDpluo真空冷凍干燥機，德國Marin Chris;DYY-12型電泳儀/電泳槽，北京市六一儀器廠;TA.XT2i型物性測試儀，英國Stable Micro Systems Ltd。

2 實驗方法

2.1 大豆籽粒發(fā)芽

挑選大小均一、無蟲蛀、無霉變、未破損的飽滿大豆籽粒，用清水清洗3次，在25℃下用水(料液比1∶2，g∶mL)浸泡10 h，每2 h換一次水。將浸泡后的大豆籽粒置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽，并根據(jù)發(fā)芽長度適時取樣，以浸泡10 h的大豆籽粒(芽長0.0 cm)作為對照。

2.2 蛋白質(zhì)含量測定

微量凱氏定氮法(GB5009.5－2003)。

2.3 GDL大豆凝膠的制備

將發(fā)芽大豆加水(料液比1∶6 g∶mL)磨漿，紗布過濾，豆?jié){在不斷攪拌下小火煮沸3～5 min，脫氣。向豆?jié){中加入2.8 g/LGDL并混勻，85℃保溫20 min后，放入冰水中冷卻成型，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 大豆分離蛋白的制備［10］

發(fā)芽大豆→40℃烘干→磨粉→脫脂→烘干→堿提酸沉法提取SPI

2.5 GDL大豆分離蛋白凝膠制備［11］

60 g/L的SPI溶液 →90℃水浴加熱15 min→加2.8 g/L GDL→80℃保溫30 min→ 冷卻 →4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 大豆凝膠強度測定

用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀測定大豆凝膠與大豆分離蛋白凝膠的凝膠強度，主要參數(shù)如下:運行模式texture profile analysis(TPA);測前速度2.0 mm/s;測試速度1.0 mm/s;測后速度3.0 mm/s;穿刺距離10mm;時間2 s;數(shù)據(jù)采集速率200 pps;圓柱型探頭(P/0.5)。凝膠破碎時受到的最大力作為凝膠強度指標，力越大凝膠強度越大［11］。

2.7 發(fā)芽前后大豆蛋白質(zhì)分子變化的測定

SDS-PAGE法［12］:采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，電泳時的電壓200 V，電流100 mA，功率50 W。3～4 h后，待溴酚藍剛剛遷移出凝膠底部時終止電泳，考馬斯亮藍染色12 h，將凝膠置于脫色液中漂洗，每隔2 h換一次脫色液，直至背景清晰為止。

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)芽過程中大豆芽長的變化

大豆發(fā)芽是一個復雜的生理生化過程，需要一系列酶的參與和消耗大量能量。大豆充分吸水后為各種酶提供了適宜的水環(huán)境，各種酶活力適度增加，種子呼吸作用加快，大豆子葉中儲藏的脂肪、淀粉為萌發(fā)提供能量而蛋白質(zhì)則提供氮源。由圖1可以發(fā)現(xiàn)大豆發(fā)芽時生長速度分為2個階段，即前36 h緩慢生長階段和36～72 h快速生長階段，這種情況是大豆內(nèi)源酶活力不斷增強的表現(xiàn)。

圖1 發(fā)芽時間與大豆芽長的關(guān)系

3.2 發(fā)芽對大豆GDL凝膠性質(zhì)的影響

大豆發(fā)芽后其凝膠性質(zhì)的變化直接影響豆腐制品的品質(zhì)，研究發(fā)芽后大豆凝膠性質(zhì)的變化對于推廣發(fā)芽大豆制品具有重要意義。因此，以葡萄糖酸內(nèi)酯GDL為凝固劑研究了發(fā)芽過程中大豆凝膠強度的變化，結(jié)果見圖2。由圖2中可以看出，未發(fā)芽大豆GDL豆腐的凝膠強度為67.8 N，當芽長1.0 cm時凝膠強度增加至73.4N。但隨著發(fā)芽時間的延長，豆芽長度增加，其大豆GDL豆腐的凝膠強度明顯降低。當芽長超過5 cm時，GDL凝膠強度小于30 N，而芽長至7.0 cm時，凝膠強度降至16.8N，僅為最高凝膠強度的22%。該結(jié)果表明影響大豆凝膠結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)發(fā)生明顯變化。

圖2 發(fā)芽對大豆GDL凝膠性質(zhì)的影響

3.3 發(fā)芽對大豆蛋白質(zhì)含量的影響

蛋白質(zhì)不僅是大豆的主要營養(yǎng)組分，也是影響其加工性能的重要成分，發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)變化直接影響發(fā)芽大豆的加工性能與營養(yǎng)價值。由圖3可以看出，在發(fā)芽初期，大豆蛋白質(zhì)含量逐漸減少，發(fā)芽36 h時蛋白質(zhì)含量最少為34.0%，然后大豆蛋白含量又有所增加，發(fā)芽72h時含量為37.6%。該實驗結(jié)果與Lee等研究不完全一致，其發(fā)現(xiàn)發(fā)芽大豆中蛋白質(zhì)含量明顯增加［1］。蛋白質(zhì)含量降低可能是浸泡過程中大豆部分可溶性氮溶于水中而產(chǎn)生的損失［13］。隨著發(fā)芽過程的持續(xù)，大豆生長不斷消耗能源物質(zhì)脂肪，蛋白合成能力增強，蛋白質(zhì)含量又重新增加。

圖3 發(fā)芽對大豆蛋白質(zhì)與氨基態(tài)氮的影響

發(fā)芽大豆中氨基態(tài)氮含量隨時間延長而持續(xù)增加，大豆中氨基態(tài)氮含量僅為3.5%，至發(fā)芽72 h時大豆氨基態(tài)氮含量增加到10.3%。分析認為氨基態(tài)氮不斷增加是大豆內(nèi)源性蛋白酶活性提高，對蛋白質(zhì)水解能力增強，使相對分子質(zhì)量較小的肽段增加并暴露出游離氨基端和羧基端的結(jié)果。這與李淑艷等［14］關(guān)于大豆中蛋白酶活性強弱與萌發(fā)種子中氨基態(tài)氮的含量密切相關(guān)的結(jié)論一致。這些結(jié)果表明發(fā)芽時大豆蛋白質(zhì)發(fā)生部分降解，可溶性部分增加。

3.4 發(fā)芽對大豆分離蛋白凝膠性質(zhì)的影響

為了更好的分析發(fā)芽過程中大豆蛋白對其凝膠強度的影響，研究分析了不同芽長大豆分離蛋白(SPI)的凝膠強度，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)芽對大豆分離蛋白凝膠性質(zhì)的影響

由圖4可以看出，SPI的凝膠強度變化趨勢與大豆一致，也是先上升后下降，芽長1.0 cm大豆SPI的凝膠強度最高為58.3N，而芽長7.0 cm的SPI凝膠強度降至14.8N，該結(jié)果表明大豆蛋白是影響大豆凝膠性能的直接因素。芽長1 cm大豆凝膠強度最高，可能是發(fā)芽中大豆內(nèi)源蛋白酶活性增加，使大豆蛋白輕度水解而發(fā)生空間結(jié)構(gòu)變化，使大豆蛋白某些基團暴露，利于相互作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而使大豆凝膠強度提高;但隨著大豆蛋白質(zhì)的不斷降解，蛋白質(zhì)聚合度減小，溶解性提高，不易形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而使大豆凝膠強度降低。

3.5 發(fā)芽對大豆SPI組成的影響

為了解大豆發(fā)芽前后蛋白質(zhì)的降解情況，分析比較不同發(fā)芽階段大豆SPI SDS-PAGE電泳圖譜，可以推測大豆SPI亞基組成的變化，進而分析出大豆SPI的變化情況。

大豆SPI根據(jù)沉降系數(shù)的不同分為2S，7S，11S，15S蛋白，其中主要由7S和11S球蛋白組成，兩者占SPI的70%以上。7S球蛋白分為β-大豆伴球蛋白、γ-大豆伴球蛋白和堿性7S球蛋白，其中β-大豆伴球蛋白是主要成分，所以通常又將7S球蛋白稱為β-伴大豆球蛋白或伴大豆球蛋白［15］。7S球蛋白是三聚體即由α'，α，β三個亞基組成，分子質(zhì)量約為150～200 ku［16］。其各亞基的分子質(zhì)量約為: α'，78 ku;α，75 ku;β，47 ku［17］，各亞基之間幾乎無二硫鍵連接。

11S 球蛋白是六聚體單一球蛋白［15，18］，分子質(zhì)量約為320～380 ku。根據(jù)11S球蛋白氨基酸序列的特點將其 5個亞基分為 2組:Ⅰ(A1aB1b，A1bB2，A2B1a)和Ⅱ(A3B4，A5A4B3)。各亞基的分子質(zhì)量約為:A3 ～37 ku，A1，A2，A4 ～34 ku，B3 ～23 ku，B1，B2，B4～22 ku［19］。每個亞基是由一條酸性多肽鏈A和堿性多肽鏈 B 通過二硫鍵連接而成的［17，19－20］。

圖5 發(fā)芽大豆分離蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜

圖5 中的1道為大豆蛋白的SDS-PAGE圖譜，從上到下的區(qū)帶分別是7S球蛋白(α'，α，β)區(qū)帶和11S 球蛋白(A3，A1A2A4，B3，B1B2B4)區(qū)帶［19］。對比大豆發(fā)芽前后SPI電泳區(qū)帶可知，發(fā)芽時大豆7S球蛋白的β亞基與11S球蛋白的堿性亞基B變化并不顯著，而7S球蛋白的α＇、α亞基與11S球蛋白的酸性亞基A3、A亞基在發(fā)芽時發(fā)生顯著變化。雖然在發(fā)芽初期(24 h內(nèi))變化不明顯，但發(fā)芽48h時區(qū)帶逐漸模糊變細，至發(fā)芽72 h時趨于消失。同時發(fā)芽48 h和72 h大豆SPI電泳圖譜中7S球蛋白的β亞基之上出現(xiàn)一條新的區(qū)帶，11S球蛋白最小的B亞基區(qū)帶處蛋白濃度明顯增加。這些結(jié)果表明發(fā)芽后，內(nèi)源蛋白酶對大豆7S球蛋白的α＇、α亞基和11S球蛋白的酸性亞基A3、A作用強，使該部分蛋白相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)亞基降解為相對分子質(zhì)量較小的部分。11S球蛋白的堿性亞基變化并不明顯，出現(xiàn)這種情況的原因可能有2個，一是堿性亞基受大豆內(nèi)源蛋白酶影響較小，二是其他SPI降解形成與其相對分子質(zhì)量相似的部分而在B區(qū)帶處匯集。此外，從電泳圖譜上還可以看到，發(fā)芽48 h時B區(qū)帶下出現(xiàn)了相對分子質(zhì)量更小的區(qū)帶，發(fā)芽72 h時這種情況更為明顯?？傊?，大豆發(fā)芽后11S球蛋白亞基比7S球蛋白亞基變化小，這可能與2種球蛋白的結(jié)構(gòu)有關(guān):7S球蛋白由3個亞基組成，容易受到外界條件影響而發(fā)生聚合和解聚;11S球蛋白由酸性亞基和堿性亞基構(gòu)成2個環(huán)狀六角形結(jié)構(gòu)，具有一定的剛性，受外界影響較?。?2］。

蛋白質(zhì)尤其是SPI是大豆形成凝膠的主要因素，7S和11S具有膠凝性并對凝膠的形成具有決定性的影響［21］，當其數(shù)量或比例發(fā)生變化可改變大豆的凝膠強度。11S主要靠二硫鍵和靜電引力形成凝膠，7S主要靠氫鍵形成凝膠［22］。11S中含有比7S更多的二硫鍵，相當于增加了肽鏈的長度，使分子間相互纏繞的機會增多［23］，因此11S組分對凝膠強度的影響高于7S組分［9］。凝膠形成過程中，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)-溶劑相互作用會達到一定程度的平衡，而決定和控制這2種相互作用平衡程度的作用力如氫鍵，疏水作用，靜電作用等也影響著凝膠的強度的改變。發(fā)芽初期大豆(芽長1.0 cm)的凝膠強度較未發(fā)芽大豆略有提高，這可能是發(fā)芽過程中蛋白酶活力提高，使大豆蛋白發(fā)生降解，肽鍵斷裂，使分子內(nèi)某些功能基團暴露出來，相鄰的分子通過二硫鍵、氫鍵、疏水作用等相互交聯(lián)［24］，蛋白質(zhì)分子間接觸的機會增多，利于大豆凝膠的形成。由SDS-PAGE圖譜分析可知，大豆發(fā)芽初期，11S球蛋白變化較7S球蛋白小，7S的降解可能使蛋白分子間形成新的相互作用，使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為緊密，凝膠強度提高。隨著發(fā)芽的進行，11S球蛋白也逐漸被降解，使維護大豆凝膠穩(wěn)定的蛋白質(zhì)亞基減少，凝膠強度降低。

4 結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)，大豆發(fā)芽前期蛋白質(zhì)含量隨發(fā)芽的進行而降低，至發(fā)芽36 h后又有所增加，而氨基態(tài)氮含量則隨發(fā)芽的進行而增加。發(fā)芽大豆的凝膠強度和SPI凝膠強度隨發(fā)芽程度變化的趨勢一致，發(fā)芽初期凝膠強度增高，然后則逐漸降低，發(fā)芽72 h時蛋白凝膠強度僅為最高凝膠強度的22%。通過分析SPI的SDS-PAGE圖譜可知，發(fā)芽對大豆11S球蛋白亞基的影響較7S球蛋白亞基小，7S球蛋白的α＇、α亞基和11S球蛋白的酸性亞基A3、A在發(fā)芽時降解明顯。而11S球蛋白在大豆發(fā)芽初期變化小，有利于蛋白質(zhì)分子之間形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠強度增強。隨著發(fā)芽時間的延長，大豆SPI降解增加，部分蛋白亞基含量顯著減少，11S球蛋白也部分發(fā)生降解，蛋白質(zhì)不易形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠強度下降。

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Effect of Germination on Properties of Soybean Gel

Wang Su-ya，Zhao Jia-hui，Ju Xing-rong，Chen Bo
(School of Food Science＆ Technology，Nanjing University of Finance＆ Economics，Jiangsu Key Laboratory of Quality Control＆ Further Processing on Grain＆ Oil，Nanjing 210046，China)

The impact of germination on gel property of soybean protein was investigated in the paper.Soybean protein isolate(SPI)were obtained from germinated soybean using alkaline extraction and acid precipitation method.After prepared by adding GDL as coagulant，soy protein gels were analyzed by Texture Analyzer.The influence of SPI changes on strength of soybean protein gel was discussed by SDS-PAGE mapping.The results showed that α＇-7S，α-7S，A3-11S and A-11S subunits were easily hydrolyzed by intra － proteases.However，all subunits of 11S globulin had less change than 7S globulin during soybean germination.At the early germination，network structure of soybean gel was easily to form among proteins and the gel strength increased，and then the gel strength decreased due to hydrolysis of 11S globulin.

germination，SPI，soybean protein gel，SDS-PAGE

博士，副教授。

2011－07－04，改回日期:2011－09－10