pH吸附法純化乳酸乳球菌素Lacticin LLC518*

方佳琪，竺德強(qiáng)，柯芳芳，陳曉琳，張明

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥，230036)

pH吸附法純化乳酸乳球菌素Lacticin LLC518*

方佳琪，竺德強(qiáng)，柯芳芳，陳曉琳，張明

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥，230036)

對(duì)乳酸乳球菌素Lacticin LLC518在不同pH條件下產(chǎn)生菌的吸附作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，pH 6.0時(shí)吸附率達(dá)100%，pH 2.0時(shí)吸附率為0。利用該特性，可將產(chǎn)生菌細(xì)胞從發(fā)酵液中分離，制備Lacticin LLC518粗制品。通過與硫酸銨沉淀樣品進(jìn)行對(duì)照，表明pH吸附法具有良好的分離效果，Lacticin LLC518的回收率為20%，純化倍數(shù)高達(dá)83.02。

乳酸乳球菌素，pH吸附，分離，層析技術(shù)，效率

細(xì)菌素是一些細(xì)菌產(chǎn)生的具有抑菌生物活性的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，一般抑制與產(chǎn)生菌同種的其它菌株或親緣關(guān)系相近的菌株［1］，但有些可以抑制親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株甚至霉菌［2］。細(xì)菌素由于可被人類腸胃道分泌的蛋白酶降解，對(duì)人體無毒副作用，因而在食品工業(yè)中可作為食品的保鮮劑，乳酸鏈球菌素Nisin就是目前廣泛應(yīng)用于食品保鮮的細(xì)菌素［3］。

在食品工業(yè)中，廣泛使用膜過濾和噴霧干燥技術(shù)制備食品保鮮用途的細(xì)菌素［4］，而在理論研究中多采用硫酸銨沉淀和各種層析技術(shù)相結(jié)合的多步法純化樣品［5－6］。1992 年 Yang等［7］研究了 Nisin 等 4 種細(xì)菌素的吸附性能，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌素對(duì)產(chǎn)生菌的最適吸附和解吸附pH值分別在6.0和2.0附近。研究表明，細(xì)菌素產(chǎn)生菌一般都能吸附其產(chǎn)生的細(xì)菌素分子［8］，吸附和解吸附的特性基于細(xì)菌素的帶電特性，且易受到各種鹽類及有機(jī)試劑的影響［9－11］，但是在吸附的過程中是否具有選擇性，尚未見報(bào)道。本文以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)LLC518對(duì)所產(chǎn)細(xì)菌素Lacticin LLC518的吸附和解吸附作用為基礎(chǔ)，以硫酸銨沉淀樣品為對(duì)照，利用各種層析技術(shù)對(duì)比分析pH吸附法的有效性，為該細(xì)菌素的進(jìn)一步純化和在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

指示菌乳桿菌(Lactobacillus sp.)LPX801和乳酸菌素Lacticin LLC518產(chǎn)生菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)LLC518均為本實(shí)驗(yàn)室篩選所得。

1.1.2 培養(yǎng)基

指示菌及細(xì)菌素產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基均為MRS培養(yǎng)基［12］。

1.1.3 主要試劑與儀器

Sephadex G－50(GE)，三氟乙酸(Sigmaaldrich)，乙腈(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)，硫酸銨(生工生物工程上海有限公司)，其它試劑均為分析純。

Aglient－1100反相高效液相色譜，Aglient;TH－500梯度混合器、HL－2橫流泵、電腦核酸蛋白檢測(cè)儀、電腦全自動(dòng)部分收集器，上海青浦滬西儀器廠;FD－1真空冷凍干燥機(jī)，北京東南儀誠(chéng)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸乳球菌素Lacticin LLC518活性及效價(jià)的測(cè)定

采用打孔法［13］測(cè)定Lacticin LLC518的活性，將OD600為1.5的乳桿菌LPX801菌懸液280 μL加入到已熔化并冷卻至50℃的30 mL MRS固體培養(yǎng)基中，混勻倒平板，待凝固后以直徑7 mm的打孔器均勻打孔，以熔化的10 μL素瓊脂封底并向孔內(nèi)等量加入待測(cè)樣品，4℃擴(kuò)散5 h后，37℃培養(yǎng)12 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。采用二倍稀釋法［14］測(cè)定Lacticin LLC518的效價(jià)，以觀察到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度定義為1個(gè)活力單位(1 AU)，其倒數(shù)即為細(xì)菌素的效價(jià)(AU/mL)。

1.2.2 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

Lowry 法［15］。

1.2.3 硫酸銨沉淀法分離制備乳酸乳球菌素Lacticin LLC518粗提液(CPA)

接種乳酸乳球菌LLC518到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)12 h作為種子液(OD600=1.5)，按4%的接種量接入250 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)24 h。4℃、8 000 r/min離心20 min。將上清液以 40% 飽和度硫酸銨進(jìn)行沉淀［16］，12 h 后，4℃，10 000 r/min離心45 min。將沉淀溶解于水，以截留分子質(zhì)量為2 000 u的透析袋對(duì)水透析12 h，收集透析液，測(cè)定其效價(jià)并冷凍干燥制成干粉。

1.2.4 空載細(xì)胞的制備［6］

按4%的接種量將乳酸乳球菌LLC518接種于500 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)24 h，4℃、8 000 r/min離心20 min，收集菌體。以5 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)洗滌細(xì)胞3次，離心后將細(xì)胞懸于1.0 mol/L NaCl溶液中。用體積比為5%的磷酸調(diào)pH值至2.0，放置30 min后重懸于無菌水中，100℃，加熱15 min，使殘留在菌體表面的細(xì)菌素失活，4℃振蕩1 h，以確保細(xì)胞表面已沒有吸附的細(xì)菌素。8 000 r/min離心20 min收集菌體細(xì)胞并重懸于100 mL無菌水中備用，檢測(cè)其抑菌活性。

1.2.5 空載細(xì)胞對(duì)細(xì)菌素吸附能力的測(cè)定［7］

稱取一定量的Lacticin LLC518干粉溶于2 mL水中，將0.1 mL的Lacticin LLC518溶液加入1.8 mL不同pH值的5 mmol/L磷酸鈉溶液中，分別加入0.1 mL細(xì)胞懸液。以0.1 mL蒸餾水代替Lacticin LLC518為對(duì)照X，以0.1 mL蒸餾水代替細(xì)胞懸液為對(duì)照Y。將上述混合物在4℃作用1 h后，15 000 r/min，離心5 min，分別取上清液測(cè)定其效價(jià)，并計(jì)算吸附率。

1.2.6 pH吸附法分離制備乳酸乳球菌素Lacticin LLC518粗提液(CPP)

按4%的接種量將乳酸乳球菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)13 h。發(fā)酵液置于70℃水浴25 min，調(diào)至最適吸附 pH 6.0，4℃放置2 h，9 000 r/min離心25 min，收集菌體細(xì)胞懸于0.1 mol/L，pH 2.0 的 NaCl溶液中，4℃，2 h 后，9000 r/min離心25 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液。將解吸附后的細(xì)胞與吸附后的上清液均勻混合，重復(fù)上述吸附和解吸附過程。合并濾液即為乳酸菌素Lacticin LLC518的粗提液。

1.2.7 pH吸附法與硫酸銨沉淀法分離效果的檢測(cè)

40%硫酸銨沉淀得到的蛋白粗提液(CPA)及pH吸附后的蛋白粗提液(CPP)經(jīng)透析處理，0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行凝膠層析和RP-HPLC分析。具體條件如下:

分子篩凝膠層析柱填料為Sephadex G－50，柱型號(hào)為26×100 cm，上樣量為5 mL，流速為1.5 mL/min。流動(dòng)相為二級(jí)水。分別收集各峰洗脫液，凍干后進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。

RP－HPLC層析采用C18半制備柱Waters Symmetry ShieldTM(5 μm ，19 mm ×150 mm)，上樣量 970 μL，流速為 2.5 mL/min，柱溫 25℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 215 nm，洗脫液A相為超純水，B相為色譜純乙腈。洗脫程序:0～6 min:0～5%B，6～66 min:5% ～100%B，66～80 min:100%B;收集各峰洗脫液，凍干后進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH吸附體系的建立

為了建立本實(shí)驗(yàn)所用菌株及細(xì)菌素的pH吸附體系，以40%飽和度硫酸銨沉淀制備的粗細(xì)菌素產(chǎn)品為吸附材料，檢測(cè)空載細(xì)胞在不同pH條件下對(duì)Lacticin LLC518的吸附率(圖1)。

圖1 不同pH對(duì)Lacticin LLC518吸附率的影響

從圖1可知，Lacticin LLC518在pH 2.0時(shí)，吸附率為0，隨后吸附率逐漸上升，在 pH 6.0時(shí)達(dá)到100%，即細(xì)菌素完全吸附于產(chǎn)生菌上，pH 7.0后吸附率逐漸下降，在 pH 10.0時(shí)，吸附率下降到27.32%，從而確定pH 6.0為吸附pH值，pH 2.0為解吸附pH值，這一結(jié)果與康牧旭等［17］研究的乳酸片球菌素PA003對(duì)產(chǎn)生菌的吸附條件近似。

2.2 硫酸銨沉淀樣品及pH吸附樣品的分析

2.2.1 凝膠層析(Sephadex G-50)

將硫酸銨沉淀樣品(CPA)及pH吸附樣品(CPP)分別進(jìn)行凝膠層析分析(圖2、圖3)，收集各峰并測(cè)定活性。

圖2 硫酸銨沉淀樣品的Sephadex G－50凝膠層析圖譜

圖3 pH吸附樣品的Sephadex G－50凝膠層析圖譜

經(jīng)凝膠層析后，硫酸銨沉淀樣品有2個(gè)峰(圖2)，經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)第1個(gè)峰為活性峰，第2個(gè)峰為雜蛋白峰。而在同一條件下，pH吸附樣品只有1個(gè)峰且抑菌活性高于硫酸銨沉淀樣品的活性，可見通過pH吸附可去除部分雜蛋白。

2.2.2 RP-HPLC

將硫酸銨沉淀樣品(CPA)及pH吸附樣品(CPP)分別進(jìn)行Sephadex G-50凝膠層析后，活性峰再經(jīng)RP-HPLC層析分析，結(jié)果如圖4及圖5。

由圖譜可知，pH吸附后的樣品出峰數(shù)少于硫酸銨沉淀樣品，且達(dá)到了基線分離，組份間分辨率較高。結(jié)果表明在pH吸附法中，菌體細(xì)胞可以較為專一地吸附發(fā)酵液中的細(xì)菌素分子，而對(duì)其他的雜蛋白吸附率不高，因而該方法可選擇性的吸附細(xì)菌素，從而提高樣品純度。

圖4 硫酸銨沉淀樣品的RP－HPLC圖譜

圖5 pH吸附樣品的RP－HPLC圖譜

2.3 不同分離方法的比活及回收率的比較

以空載細(xì)胞作為吸附細(xì)胞時(shí)，Lacticin LLC518在pH 6.0時(shí)的吸附率達(dá)到了100%。為了明確pH吸附法從發(fā)酵液中分離Lacticin LLC518的效果，以pH 6.0吸附、pH 2.0解吸附為試驗(yàn)條件從發(fā)酵液中分離制備Lacticin LLC518粗制品，其比活由發(fā)酵原液的10.67 AU/mg提高到885.81 AU/mg，純化倍數(shù)提高83.02倍。硫酸銨沉淀法制備的粗制品比活提高到334.64 AU/mg，純化倍數(shù)提高31.36倍(表1，表2)。

表1 硫酸銨沉淀純化Lacticin LLC518的純化表

表2 pH吸附法純化Lacticin LLC518的純化表

由表1及表2可知，經(jīng)pH吸附法分離純化后， 樣品純化倍數(shù)高于經(jīng)硫酸銨沉淀法制備的樣品。2種粗制品經(jīng)G－50凝膠層析后，純化倍數(shù)分別為139.09和38.57，且前者比活為1484.06，比之 CPA提高了3.6倍，說明pH吸附法分離效果較硫酸銨沉淀法好。但回收率僅為20%，低于硫酸銨沉淀法的36.09%。為了提高回收率，采用多次吸附的方法對(duì)發(fā)酵液中的細(xì)菌素進(jìn)行了吸附研究(圖6)。

圖6 多次吸附對(duì)Lacticin LLC518吸附效率的影響■－上清液中蛋白質(zhì)濃度;●－解吸液蛋白質(zhì)濃度國(guó);▲－上清液抑菌圈直徑;▼－回收率

由圖6可知，多次吸附后上清液蛋白質(zhì)濃度呈下降趨勢(shì)，減少的蛋白質(zhì)量與解吸液中的蛋白質(zhì)濃度基本保持一致，說明蛋白質(zhì)被細(xì)胞吸附后能夠有效的釋放到解吸液中，因而利用空載細(xì)胞建立的吸附解吸附系統(tǒng)可以有效的應(yīng)用于發(fā)酵液中細(xì)菌素的分離。

在第1次和第2次吸附后，上清液的蛋白質(zhì)濃度下降較大，分別從49.25 mg/mL下降到43.14 mg/mL和從43.14 mg/mL下降到36.30 mg/mL。但上清液的抑菌作用在第1次吸附前后變化較小，說明較多抑菌物質(zhì)未被吸附，仍殘留在上清液中，而經(jīng)2次吸附后，上清液的抑菌作用顯著降低，說明大部分的細(xì)菌素被吸附。造成這一現(xiàn)象的主要原因可能在于第1次吸附時(shí)細(xì)胞的吸附位點(diǎn)上可能已經(jīng)有部分細(xì)菌素占據(jù)，或由于發(fā)酵液中存在著大量的細(xì)菌素而吸附位點(diǎn)數(shù)量有限而趨于飽和。在第1次解吸附處理后，大量吸附位點(diǎn)得到釋放，進(jìn)而在第2次吸附時(shí)可以進(jìn)一步吸附大量的細(xì)菌素，最終使第2次吸附后，殘留在上清液中的細(xì)菌素大量減少，因而抑菌活性顯著減低。

但隨著吸附次數(shù)的增加，特別經(jīng)第5次吸附后，上清液中殘留的蛋白質(zhì)含量維持穩(wěn)定，抑菌作用變化較小，說明后續(xù)增加吸附次數(shù)并不能增加細(xì)菌素的吸附以及雜蛋白的吸附，因而利用pH吸附法吸附細(xì)菌素專一性較強(qiáng)。同時(shí)，每次吸附的回收率隨著吸附次數(shù)的增加而降低，由第1次的20%下降到第5次的0.63%，但總回收率達(dá)到53.13%，高于硫酸銨沉淀法的36.09%。

3 結(jié)論

乳酸乳球菌LLC518產(chǎn)生的乳酸乳球菌素Lacticin LLC518具有安全、抑菌活性強(qiáng)、抑菌譜廣的特性，有作為天然食品防腐劑的潛力。為了進(jìn)一步開發(fā)利用該細(xì)菌素，本文以Yang等［7］建立的pH吸附法為參照，研究了Lacticin LLC518的吸附規(guī)律，結(jié)果表明Lacticin LLC518對(duì)其產(chǎn)生菌細(xì)胞的吸附具有pH依賴性，在pH 6.0時(shí)完全被吸附到細(xì)胞上，在pH 2.0時(shí)完全解吸附。借助此pH吸附模型利用發(fā)酵液中的細(xì)菌素產(chǎn)生菌對(duì)所產(chǎn)Lacticin LLC518進(jìn)行了分離純化。以硫酸銨沉淀樣品為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)pH吸附法的分離效果優(yōu)于常用的硫酸銨沉淀法，其純化倍數(shù)為83.02高于硫酸銨沉淀法的31.36，并通過多次吸附處理提高了回收率，總回收率高達(dá)53.13%，凝膠層析和RP-HPLC的分析亦表明pH吸附法樣品較硫酸銨沉淀樣品雜峰少，說明pH吸附法具有良好的分離效果。本研究的結(jié)果為建立Lacticin LLC518的最佳純化方法，進(jìn)而對(duì)該細(xì)菌素性質(zhì)的研究以及擴(kuò)大化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Todorov S D，Dicks L M T.Bacteriocin production by Pediococcus pentosaceus isolated from marula(Scerocarya birrea)［J］.Int J Food Microbiol，2009，132(2/3):117 －126.

［2］ Smaoui S，Elleuch L，Bejar W，et al.Inhibition of Fungi and Gram－Negative Bacteria by Bacteriocin BacTN635 Produced by Lactobacillus plantarum sp.TN635［J］.Appl Biochem Biotechnol，2010，162(4):1 132 －1 146.

［3］ Govaris A，Solomakos N，Pexara A，et al.The antimicrobial effect of oregano essential oil，nisin and their combination againstSalmonella enteritidis in minced sheep meat during refrigerated storage［J］.Int J Food Microbiol，2010，137(2/3):175－180.

［4］ 梁恒宇，黃亦存，張欽革.一種乳酸鏈球菌素的制備方法［P］.中國(guó)專利，200710072250.6.2008－01－30.

［5］ Kumar M，Tiwari S K，Srivastava S.Purification and characterization of enterocin LR/6，a bacteriocin from Enterococcus faecium LR/6［J］.Appl Biochem Biotechnol，2010，160(1):40－49.

［6］ 劉書亮，敖靈，周佳，等.戊糖乳桿菌素C50－6的純化及特性研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(5):36－40.

［7］ Yang R，Johnson M C，Ray B.Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria［J］.Appl Environ Microbiol，1992，58(10):3 355 －3 359.

［8］ Tulini F L，de Martinis E C P.Improved Adsorption－Desorption Extraction Applied to the Partial Characterization of the Antilisterial Bacteriocin Produced by Carnobacterium maltaromaticum C2［J］.Braz J Microbiol，2010，41(2):493－496.

［9］ 張金蘭，程萬(wàn)鵬，暢曉淵，等.pH吸附法純化戊糖乳桿菌素31－1的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(12):350－354.

［10］ Todorov S D，Powell J E，Meincken M，et al.Factors affecting the adsorption of Lactobacillus plantarum bacteriocin bacST8KF to Enterococcus faecalis and Listeria innocua［J］.Int J Dairy Technol，2007，60(3):221 －227.

［11］ Todorov S D，Dicks L M T.Parameters affecting the adsorption of plantaricin 423，a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum 423 isolated from sorghum beer［J］.Biotechnol J，2006，1(4):405 －409.

［12］ 張剛.乳酸細(xì)菌—基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

［13］ Gupta H，Malik R K，Bhardwaj A，et al.Purification and characterization of enterocin FH 99 produced by a faecal isolate Enterococcus faecium FH 99［J］.Indian J Microbiol，2010，50(2):145 －155.

［14］ Zhang J，Liu G，Shang N，et al.Purification and partial amino acid sequence of pentocin 31－1，an anti－Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus pentosus 31 －1［J］.J Food Prot，2009，72(12):2524 －2529.

［15］ 汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2002:38－50.

［16］ 蔣立科，楊婉身.現(xiàn)代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003:24－28.

［17］ 康牧旭，周志江.pH吸附法純化乳酸片球菌素的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(7):94－99.

The Studies on Purification of Lacticin LLC518 by pH-Adsorption Method

Fang Jia-qi，Zhu De-qiang，Ke Fang-fang，Chen Xiao-lin，Zhang Ming
(College of Life Sciences，Anhui Agriculture University，Hefei 230036，China)

The adsorption rates of Lacticin LLC518 on Lactococcus lactis subsp.lactis 518 at different pH conditions were studied.The results showed that the adsorption rate was 100%at pH 6.0 while no Lacticin LLC518 was adsorbed at pH 2.0.Therefore，the crude Lacticin LLC518 was prepared from the cell-free supernatant of the L.lactis subsp.lactis 518 culture when the exterior environment had a pH of 6.0 and 2.0 by absorbing and desorbing Lacticin LLC518，respectively.The pH absorption method has an obvious advantage superior to the ammonium sulphate precipitation method for its better absorption effect when the crude Lacticin LLC518 from precipitation with ammonium sulfate as a control.The specific activity of Lacticin LLC518 was increased 83.02 fold with a yield of 20% .

Lacticin，pH －adsorption，isolation，chromatography technology，efficiency

碩士研究生(張明為通訊作者)。

*國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z319);安徽省高等學(xué)校省級(jí)質(zhì)量工程項(xiàng)目(20101899)

2011－05－08，改回日期:2011－08－26